連作對浙貝母根際土壤細菌群落結構的影響

潘霞 胡盈盈 陳澤宇

摘 要：以浙江省磐安浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）為研究對象，利用PCR-DGGE技術，研究連作對浙貝母根際土壤細菌群落結構的影響。結果表明，連作條件下浙貝母根際土壤細菌群落結構發生改變，主要表現為細菌種群數量顯著減少;但連作年限對浙貝母根際土壤細菌多樣性的影響較小，細菌群落結構變化不明顯。對浙貝母根際土壤細菌種群的DGGE電泳結果進行主成分分析，分析結果顯示，所取浙貝母土壤樣品的細菌優勢種群為蠟樣芽胞桿菌群（Bacillus cereus.Frankland）、芽胞桿菌屬（Bacillus Cohn）和鞘氨醇單胞菌屬（Sphingomonas）。綜上表明，浙貝母連作后根際土壤細菌群落結構和功能的改變可能是導致浙貝母連作障礙產生的重要原因之一。

關鍵詞：浙貝母;連作;根際土壤;細菌群落

一、材料與方法

1.實驗材料.浙貝母根際土壤樣品采自浙江省磐安塘下村種植大田。土壤以紅壤為主，浙貝母種植基本為連作種植，除連作年限外土壤處理背景一致。取浙貝母未連作土壤、連作2年土壤、連作多年根際土壤樣品。

2.研究方法

（1）取樣方法，去除2～3 cm的表層土，完整挖出浙貝母的全部根系，將大塊土抖落，取附著在根系上的細土至干凈的取樣袋中，不同連作年限的浙貝母根際土壤各取三份作為實驗組，取未連作土壤三份作為對照。采樣后密封保存在4℃冰箱中。

（2）土壤DNA的提取純化，釆用OMEGA的E.Z.N.A.Soil DNA Kit試劑盒提取浙貝母根際土壤的微生物總DNA。

（3）16S rDNA V3 片段 PCR 擴增。擴增目的DNA為細菌16S部分核糖體核苷酸序列。PCR程序模式為touchdown-PCR程序。反應總體系為ddH2O 17 μL，10×buffer 2.5 μL，dNTP 2 μL，Primer 534 1 μL，Primer 341-GC 1 μL，Ex Tag酶0.5 μL和DNA模板1 μL。擴增后的PCR產物在1%瓊脂糖凝膠上進行電泳檢測。

（4）變性梯度凝膠電泳，配置高低兩種濃度的凝膠溶液，加入40 μL 10%過硫酸銨與10 μL TEMED，并迅速渦旋注入連通柱。打開連通閥并運轉蠕動泵，轉速為15 rpm。待凝膠溶液注入玻板指定高度后，將泵管置于廢液缸，立即往灌膠器中注滿MQ，開始清洗。

在電泳槽中注入1×TAE緩沖液。放入加熱罩后設置緩沖液加熱溫度為65℃。待膠凝固，往玻璃板中插入樣梳，并使之傾斜，用移液槍灌注上層膠，加入4 mL后，將樣梳擺正。待膠凝固，拔出樣梳，用1×TAE清洗。每個點樣孔上樣液為PCR產物15 μL、3×loading buffer 7.5 μL。將電泳液溫度設置為60℃，電泳為50 V，13 h。當電泳結束，切去上層膠，并在上樣端切角標記。本實驗采用銀染法進行染膠。染色結束后用Bio-Rad Gel Doc 2000凝膠成像系統對觀察到的結果進行拍照，最后用Bio-Rad Quantity One軟件對DGGE條帶進行分析。

（5）割膠回收與克隆測序。挑選DGGE電泳膠上的優勢條帶并進行割膠回收，之后進行純化。純化產物用pMD-18-T載體進行克隆。選取較亮的PCR條帶所代表的菌液作為測序菌液進行分裝，送至上海生工公司進行測序。

二、結果與分析

PCR擴增產物經DGGE檢測后獲得多條清晰條帶。條帶隨著連作年限增加亮度降低，連作多年的浙貝母土壤樣品較連作兩年的DGGE條帶亮度變化較小，個別條帶在亮度上有差別。從條帶數量上看，隨著連作年限增加，DGGE條帶數目逐漸減少。同樣，連作多年的土壤樣品較連作兩年的土壤樣品DGGE條帶數量變化不明顯。DGGE電泳條帶數可以近似認為是細菌種群的數量，而條帶的亮度則反映了該種細菌數量的多少[8]。據此初步推斷，連作導致浙貝母根際土壤細菌種群的數量減少，影響了根際土壤中細菌群落的組成。

通過測序結果可知，浙貝母連作兩年與連作多年土壤樣品中細菌種群數較未連作土壤樣品中細菌種群數顯著減少。但連作多年土壤樣品中細菌種群數量和連作兩年土壤樣品中細菌種群數量無明顯差別。隨著連作年限的增加，個別種群的細菌數量也逐漸減少，可以從同一層次的條帶亮度逐漸降低看出。連作兩年的土壤樣品中，條帶1B、2B、3B和9B特別亮，經序列分析，推斷其為蠟樣芽胞桿菌群、芽胞桿菌屬及鞘氨醇單胞菌屬，相似菌株最大相似度分別為99%、99%和100%。連作多年的土壤樣品中，上述菌數量減少，其條帶亮度降低。據此推斷，在連作條件下，浙貝母根際土壤細菌群落結構發生變化，土壤微生態環境改變，影響了浙貝母的生長。而土壤細菌群落結構和功能的改變，與連作障礙有著密不可分的關系。

3 討論

在連作情況下，浙貝母根際土壤細菌群落結構多樣性指數低于未連作狀態，隨著連作年限增長，細菌種群數量減少并不明顯。對根際土壤細菌群落的DGGE結果進行主成分分析，結果表明，連作后土壤細菌群落結構組成有明顯變化，土壤中優勢種群為蠟樣芽胞桿菌群、芽胞桿菌屬和鞘氨醇單胞菌屬。研究發現，作物連作后對土壤根際微生物的生長繁殖具有選擇性，能夠促進或抑制某些微生物生長，進而改變微生物種群的多樣性。根際土壤微生物功能的差異會影響植物所需營養物質的提供[9]，而植物對土壤中營養物質的選擇，可能是導致連作障礙產生的原因。

由以上討論可知，連作后浙貝母根際土壤細菌群落組成及功能的改變，使得浙貝母根際土壤微生態環境發生了變化，這與浙貝母連作障礙相關。但連作后浙貝母根際微生物群落除了上述菌落外，其結構組成中還有哪些菌群發生了比較大的改變，以及它們與浙貝母連作障礙的機理關系還有待進一步研究。

參考文獻

[1]張明發，沈雅琴.浙貝母藥理研究進展[J].上海醫藥，2007.28（10）：459-461.

[2]中國醫學科學院藥物研究所.中藥志[M].北京：人民衛生出版社，1959，148-152.

[3]趙鸝.麗水市浙貝母產業化發展策略與規范化生產技術研究[D].浙江杭州：浙江大學，2004.

（作者單位：浙江師范大學，化學與生命科學學院）