miR-146a對甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8 的調(diào)節(jié)作用

李凱軍 陳俊

摘要：目的：探討miR-146a對甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8的調(diào)節(jié)作用。方法：本研究設(shè)實驗組和對照組兩組，通過原代細胞培養(yǎng)技術(shù)獲得體外培養(yǎng)眼眶成纖維細胞，再利用攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細胞，過表達或抑制眼眶成纖維細胞miR-146a的表達水平，進而通過ELISA法檢測IL-6和IL-8的表達水平。結(jié)果：TAO患者眼眶成纖維細胞48h上清液中IL-6和IL-8水平明顯升高，結(jié)果與正常組有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纖維細胞中，上調(diào)miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同時，下調(diào)miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。結(jié)論：過表達miR-146a可抑制眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達，同時抑制miR-146a可促進眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達。

關(guān)鍵詞：甲狀腺相關(guān)性眼病，眼眶成纖維細胞，miR-146a，IL-6，IL-8

【中圖分類號】R581.3??? 【文獻標識碼】A??? 【文章編號】2107-2306（2019）03-022-02

引言

甲狀腺相關(guān)性眼病（Thyroid-associated ophthalmopathy， TAO），是一種器官特異性自身免疫性疾病[1]。眼眶成纖維細胞是甲狀腺相關(guān)眼病的自身免疫靶點和效應細胞[2]。IL-6是主要的促炎細胞因子[3]。成纖維細胞中IL-8的產(chǎn)生參與甲狀腺相關(guān)眼病炎癥進展[4]。

miR-146a是典型的多功能miRNA，參與免疫調(diào)節(jié)，細胞增殖，分化，凋亡，細胞外基質(zhì)代謝和其他生命過程[5]。楊文娟等[6]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺相關(guān)眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血單個核細胞的miRNA-146a相對表達量較正常人明顯下降。然而，miR-146a對眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的影響仍不清楚。本研究旨在通過原代細胞培養(yǎng)技術(shù)獲取純化的眼眶成纖維細胞，利用攜帶目的基因的慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細胞，過表達或抑制miR-146a的表達水平，進而利用ELISA法檢測IL-6和IL-8的表達水平，探討miR-146a對甲狀腺相關(guān)眼病眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8的調(diào)節(jié)作用。

方法

1.實驗材料

實驗組：因暴露性角膜炎、壓迫性視神經(jīng)病變或限制性眼外肌病變行眼眶減壓術(shù)或斜視矯正術(shù)的甲狀腺相關(guān)眼病患者6例，術(shù)中取眼眶球后結(jié)締組織。

對照組：因眼外傷等原因引起眼球萎縮行眼球摘除術(shù)及義眼座植入術(shù)以及二期義眼座植入術(shù)6例，術(shù)中取眼眶球后結(jié)締組織。

1.慢病毒的構(gòu)建及慢病毒轉(zhuǎn)染眼眶成纖維細胞的條件

本實驗需要的含目的基因的重組慢病毒載體由上海基凱基因公司協(xié)助構(gòu)建完成，根據(jù)上海基凱基因公司所提供的慢病毒感染實驗手冊指導實驗。

2.轉(zhuǎn)染后ELISA檢測眼眶成纖維細胞Il-6和IL-8的表達水平

取生長良好的眼眶成纖維細胞，調(diào)整細胞密度，各組眼眶成纖維細胞按4x104/ml接種6孔板，培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48h后，收集各組上清液，參照ELISA試劑盒使用說明，檢測細胞上清液中Il-6和IL-8的表達水平。

3.統(tǒng)計學分析

實驗結(jié)果采用SPSS 20.0對數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計學分析。P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié)果轉(zhuǎn)染后ELISA檢測眼眶成纖維細胞Il-6和IL-8的表達水平

TAO患者眼眶成纖維細胞較正常眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8水平明顯升高，結(jié)果與正常組有統(tǒng)計學差異（P<0.05）。在TAO患者眼眶成纖維細胞中，上調(diào)miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;同時，下調(diào)miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平升高（P<0.05）。在正常人眼眶成纖維細胞，上調(diào)miR-146a表達水平，IL-6和IL-8水平下降（P<0.05）;下調(diào)miR-146a表達水平，IL-8水平升高（P<0.05）。

討論

miR-146a是典型的多功能miRNA，參與免疫調(diào)節(jié)，細胞增殖，分化，凋亡，細胞外基質(zhì)代謝和其他生命過程[7]。Sun等[8]通過qPCR比較甲狀腺相關(guān)眼病和非甲狀腺相關(guān)眼病患者眼眶脂肪組織中miR-146a的表達水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)眼眶成纖維細胞中的炎性應激能使miR-146a上調(diào)。楊文娟等[6]發(fā)現(xiàn)，甲狀腺相關(guān)眼病患者和甲亢不伴有眼病患者的外周血單個核細胞的miRNA-146a相對表達量較正常人明顯下降。然而，本實驗研究TAO患者眼眶成纖維細胞較正常眼眶成纖維細胞IL-6和IL-8水平明顯升高。由此可見，在自身免疫性疾病中，miR-146a的表達可能有不同的復雜機制。

IL-6在甲狀腺相關(guān)眼病中也有重要的作用。已有研究表明，眼眶容量與IL-6mRNA的表達呈正相關(guān)，與IL-4mRNA、IL-10mRNA呈負相關(guān)[9]。相較于非活動性甲狀腺相關(guān)眼病患者，活動性甲狀腺相關(guān)眼病患者血清IL-6和可溶性型IL-6受體濃度明顯升高[3]。Ning等[10]發(fā)現(xiàn)與對照組相比，甲狀腺相關(guān)眼病患者外周血的miR-146a的相對表達顯著增加，而Notch2的相對表達明顯降低，且 Notch2可以被miRNA-146a直接作為靶向目標。外源性miRNA-146a模擬物可下調(diào)Notch2的表達和上調(diào)IL-6。抑制miRNA-146可以導致Notch2的表達升高和IL-6的表達降低。這些結(jié)果說明miR-146a可通過直接靶向作用Notch2增加IL-6水平，從而促進甲狀腺相關(guān)眼病的發(fā)展。在我們的研究中，過表達miR-146a可抑制眼眶成纖維細胞中IL-6的表達，同時抑制miR-146a可促進眼眶成纖維細胞中IL-6的表達。

IL-8是促炎趨化因子，具有誘導中性粒細胞沿著血管壁的聚集的作用[11]。在甲狀腺相關(guān)眼病中，各種類型的成纖維細胞以及這些細胞中IL-8的大量產(chǎn)生參與疾病炎癥進展[12]。在眼眶炎癥中，眼眶成纖維細胞在一些細胞因子的刺激下，如IL-1β、TNF-α、脂多糖和IFN-γ，產(chǎn)生劑量依賴的IL-8和MCP-1[13]。在我們的研究中，過表達miR-146a可抑制眼眶成纖維細胞中IL-8的表達，同時抑制miR-146a可促進眼眶成纖維細胞中IL-8的表達。

過表達miR-146a可抑制眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達，抑制miR-146a可促進眼眶成纖維細胞中IL-6和IL-8的表達。提示miR-146a可能與甲狀腺相關(guān)眼病疾病的發(fā)生發(fā)展有關(guān)。

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