OPG/RANKL/RANK信號通路在骨質疏松癥中的研究 進展

李佳 欒志偉 黃星 姚軍

骨質疏松癥（ osteoporosis，0P） 是多種病因引起的一組骨病，以單位體積內骨組織量減少為特點的一種全身性的骨代謝疾病。在多數0P中，骨組織的減少主要由于骨質吸收增多所致，以骨骼疼痛、易于骨折為特征。在老年人群中更為多見，是導致老年人致殘的主要原因之一[1]。我國人群40歲以上骨質疏松患病率約20%。我國60-69歲的老年女性的0P發生率高達50%-70%，老年男性為30%[2]。OP并發癥致殘率高，最嚴重的并發癥是骨質疏松性骨折，以髖部骨折最為嚴重，嚴重影響患者的生活質量，給家庭和社會帶來沉重的負擔。

目前0P的病因及發病機制并不完全清楚，正常成人的骨骼中成骨細胞與破骨細胞處于一種動態平衡，使骨組織不斷更新，以維持骨骼的強度和彈性，骨保護蛋白（OPG），核因子-κB （NF-κB） 配體激活受體（RANKL）、腫瘤壞死因子家族新成員（RANK）參與并調節骨的動態平衡，這一動態平衡被破壞后導致骨的丟失引起骨質疏松[3]。隨著骨細胞分子生物學研究的進展，發現OPG/RANKL/RANK信號通路是調控破骨細胞及骨質疏松癥的重要途徑，在破骨細胞的形成和抑制中起著重要的調控作用。許多激素、細胞因子、生長因子通過作用于該信號通路影響骨代謝而導致0P。因此，對OPG/RANKL/RANK信號通路的深入研究，可為0P提供潛在的治療新途徑。

1、成骨細胞與破骨細胞

1.1成骨細胞（osteoblast OB）OB來源于骨髓間充質干細胞，是骨形成過程中的重要功能細胞，是唯一負責骨形成的細胞類型，主要功能是分泌骨基質并調節其鈣化，最終形成大量骨鹽沉積。OB通過Wnt信號/β-catenin信號通路調節骨形成，此外OB在骨吸收中也扮演著重要的角色。OB產生的M-CSF，RANKL和OPG在破骨細胞形成和功能中起著必不可少的作用。

1.2 破骨細胞（osteoclast OC）OC是一種巨大的多核細胞，在骨髓基質細胞分泌的多種因子作用下由單核細胞前體融合而成。由骨重建單元（BRUs）內或其

周圍的細胞分泌的巨噬細胞克隆刺激因子（M-CSF）、核因子-κB （NF-κB） 配體激活受體（RANKL）等細胞因子的作用下刺激分化產生[4]。研究發現RANKL的增高與OC的激活存在一定的相關性，RANKL與OC及其前體細胞表面上的RANK結合后，能促進OC的分化、增殖、多核化以及增強骨吸收[5]。

1.3成骨細胞與破骨細胞的相互調節作用 OB不僅與骨形成密切相關，而且在骨吸收過程中也起著關鍵性作用。體外實驗發現，OB是調控骨吸收的中心細胞，大部分骨吸收因子的受體只存在于OB而非OC上，OB接受骨吸收因子的刺激后分泌RANKL，在M-CSF存在的前提下，RANKL與M-CSF結合到OC的前體細胞表面受體RANK和M-CSFR上，RANK胞內區的特異性位點與OC內的腫瘤壞死因子受體相關蛋白（TRAFs）結合，即TRAF-6，引起OC下游信號的鏈式反應[6]。而OB分泌的OPG則以二聚體的形式競爭性地與三聚體RANKL結合，阻斷RANK與RANKL的結合，從而抑制OC的形成和成熟過程。骨髓基質干細胞向OB分化的過程中，OPG與RANKL的比值處于動態變化之中，隨著OB與基質細胞的分化成熟，RANKL/OPG的比值縮小，最后將失去對OC的分化和成熟過程的調控，從而使骨形成與骨吸收達到動態平衡。故OB通過OPG/RANKL/RANK信號系統調節著對OC分化活化與凋亡的關系。

2、OPG/RANKL/RANK信號通路概述

2.1骨保護素（OPG）OPG是1997年Simonet等[7]在測序胎鼠小腸cDNA文庫時發現的段序列，因其所表達的蛋白具有骨保護的作用而命名。OPG是OB和骨髓間充質干細胞分泌的一種分泌型糖蛋白。OPG的蛋白有7個結構域，形成3個功能區：①腫瘤壞死因子受體包括1-4結構域，形成OPG的主要結構域，執行抑制OC的功能。②同源區5-6屬于死亡域，與Fas蛋白跨膜區形成融合蛋白，具有很強的細胞毒性，可以引起細胞的凋亡。③肝素結合屬于第7結構域，其作用尚未明確[8]。

2.2 RANKL RANKL是于1998年Lacey等用OPG做探針時發現的OB或基質細胞表面表達的OPG配體蛋白，人RANKL基因位于染色體13q14，其分子由317個氨基酸組成，分為3種亞型，跨膜蛋白RANKL1、RANKL2以及分泌型RANKL3，以RANKL1存在最為廣泛[9]。RANKL由OB、T細胞和內皮細胞表達，是OC形成的關鍵因子。近幾年有文章描述RANKL的逆向信號現象，逆信號現象即跨膜的信號蛋白不僅可以向它的受體傳遞信號，還可以作為“反受體”接受信號，將細胞外的信息轉導如宿主細胞內。有證據表明表達RANKL的T細胞可接受來自重組RANK蛋白或重組OPG蛋白的逆向信號，從而促進T細胞凋亡。對同樣表達RANKL的OB，RANK是否可以通過RANKL發送逆向信號從而影響OB的功能狀態尚未有研究證實 [10]。另外RANKL在OB高爾基體中大量儲存，OPG則可使RANKL保持在胞內，減少其釋放至胞膜及胞外[11]。

2.3 RANK? RANK于1997年Anderson等在直接測定人骨髓衍生樹突狀細胞cDNA時發現的。RANK在骨骼肌、小梁骨、肝臟、小腸以及腎上腺均有表達。RANK由616個氨基酸組成，可與TRAF1，2，3，5，6結合。RANK在體內主要存在于可溶型和跨膜蛋白型兩種方式：前者在血液中存在，可發揮阻斷RANKL促進OC分化生長的功能; 后者存在于OC表面，選擇性地與RANKL結合，促使骨吸收[12]。RANK與RANKL結合后被激活，通過TRAFs啟動胞質內的信號級聯反應，RANK有3個結合位點與TRAF2，5，6結合，其中最重要的是TRAF轉接RANK的刺激并傳導給下游的NF-κB、JNK和Src通路，從而促進OC的分化、成熟及阻止OC凋亡。

3、OPG/RANKL/RANK信號通路的信號轉導

3.1 OPG/RANKL/RANK信號系統通過激活一系列的信號級聯反應，啟動和調控基因的轉錄來調節OC的分化、活化和凋亡。RANKL可以提高NF-κB和c-Jun氨基末端蛋白激酶（JNK）的活性。因此NF-κB、蛋白激酶C途徑、JNK與OPG/RANKL/RANK信號系統的激活有關[13]。RANK在細胞內的特殊位點與TRAF的結合是所有信號傳導中最為關鍵的一步。RANK信號轉導途徑的激活使TRAF6蛋白積聚，IKK激活，IκB被磷酸化降解，激活 NF-κB，并進入細胞核執行核內轉錄過程，增加AP-1家族中的c-Fos的表達，c-Fos進一步與活化的T細胞核因子結合并相互作用，啟動OC生成基因的轉錄。一般情況下RANKL可以激活腫瘤壞死因子受體相關因子6（ TRAF6），后者進一步激活NF-κB和c-Jun氨基末端激酶（ JNK） 通路，同時促使C-Fos表達，故TRAF6和C-Fos是OC形成所必需的。此外，RANKL與RANK的結合激活了內在的信號傳導級鏈，膜結合型RANKL或可溶性的RANKL結合并活化受體RANK，RANK刺激通過轉接分子（諸如TRAF和Gab 2） 誘導的NF-κB、MAPK和磷脂酰肌醇途徑以控制OC生成。破骨細胞最終形成的標志性事件是NFATc1的激活，NFATc1的表達依賴于TRAF6-NF-κB及c-Fos通路。激活的NF-κB可移至細胞核內與NFATc1的啟動子結合，并且RANKL刺激后幾分鐘內NFATc2亦結合于NFATc1的啟動子上，NFATc2與NF-κB共同激活NFATc1的啟動子，上調NFATc1的早期表達，并且在RANKL誘導下，TRAF6募集于RANK的胞質端，進而動員細胞內的鈣信號激活鈣神經素，活化的鈣神經素去磷酸化并激活NFATc1，隨后NFATc1轉移至細胞核內，在其啟動子上與c-Fos、c-Jun形成三元絡合物，進而刺激NFATc1的自身放大表達 [14]。研究發現miRNA能通過調節不同的細胞因子從而影響OC的分化，例如TRAF6是miR -125a的靶基因，而NFATc1作為TRAF6的下游靶點，能夠通過結合miR -125a的啟動子來調節其表達，因此，miR -125a與TRAF6和NFATc1構成了一個負反饋調節通路來調節OC的分化和成熟[15]。

4、OPG/RANKL/RANK信號通路的表達調控

4.1 激素 許多激素通過作用于OPG/RANKL/RANK信號通路影響骨代謝。雌激素是參與骨代謝的一種非常重要的激素，雌激素不僅可以促進OPG的分泌，也可以直接抑制RANKL受體激活和M-CSF介導的骨髓單核祖細胞分化為OC。研究發現雄激素可以通過調節成骨細胞OPG系統相關基因的表達影響OB對OC的介導功能，并發揮其對骨形成的作用[16]。降鈣素（CT）可抑制OC，促進OB的形成，使骨組織釋放入細胞外液的鈣鹽減少，鈣鹽沉積增加。甲狀旁腺激素（PTH）是一種促進骨吸收的激素，PTH能刺激OC增殖并加強其活動，還可抑制OB活動，從而使骨質溶解，減少鈣鹽在骨中沉積。但PTH對骨吸收的作用可被雌激素所抑制，絕經后雌激素缺乏會使骨對PTH的敏感性增加。

4.2 細胞因子 許多細胞因子能通過作用于RANKL來參與骨代謝，某些促進骨吸收的細胞因子，如M-CSF、前列腺素E2（PGE2）、白細胞介素（IL）-1和IL-6、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）等均可刺激RANKL大量表達，促進其與OC前體表面的RANK結合，誘導多核OC的分化成熟。某些骨保護因子，如轉化生長因子-β（TGF-β）、IL-7等，介導產生的OPG競爭性地結合RANKL，抑制OC分化成熟和骨吸收。

4.3 生長因子生長因子是另一類OPG/RANKL的調節器，胰島素樣生長因子（IGF-1）是骨代謝的一個重要生長因子，隨年齡增長骨組織對IGF-1的反應性降低。研究表明IGF-1能促進RANKL的表達[17]。色素上皮衍生因子表達在骨組織上可以促進OB分化，可以促進OPG在OB上分泌，也可以抑制RANKL的表達從而抑制OC的分化。

4.4維生素 1， 25-（OH）2D3是促進OC形成及發揮骨吸收作用時的一種重要刺激因子，其與維生素D3受體結合可上調OB或基質細胞中RANKL的表達，而RANKL可特異性的結合RANK，激活相關信號的級聯反應，促進OC前體分化、融合為OC。同時，1，25-（OH）2D3還可通過調節骨微環境 M-CSF mRNA 的表達，促使M-CSF與其受體c-Fms結合，對OC的形成及增殖具有間接促進作用[18]。1，25-（OH）2D3可刺激位于OC封閉帶上整合素αvβ3的表達，而封閉帶對Ca2+濃度和pH的變化較為敏感，Ca2+作為第二信使，對下游信號的調節具有特異性作用，可影響OC的形成分化及功能發揮。

5、OPG/RANKL/RANK信號通路與骨質疏松癥的作用

0P依據病因可分為：1）原發性骨質疏松：是隨著年齡的增長必然發生的一種生理性退行性病變，分為絕經后骨質疏松癥和老年性骨質疏松癥;2）繼發性骨質疏松：指因某些疾病或藥物導致的骨丟失，如風濕性關節炎、藥物誘導性骨質疏松癥導致的骨丟失。

5.1原發性骨質疏松癥

5.11絕經后骨質疏松癥（PMO）PMO是由于婦女絕經后雌激素的嚴重缺乏，致OC活性增加，骨膠原的成熟和鈣化被抑制，引起繼發性鈣鹽減少及骨組織微結構的改變，造成的高轉換型骨質疏松。雌激素可通過OPG/RANK/RANKL信號通路參與調節OC生成和抑制骨吸收作用。雌激素主要通過兩條途徑影響骨代謝：1）雌激素通過與OC和OB上的雌激素受體（ER）結合，直接調節骨代謝。雌激素與OB表面的ER結合，促進膠原酶的分泌，釋放生長因子和細胞因子來促進骨的形成。雌激素通過ER途徑直接作用于破骨細胞前體或成熟的破骨細胞，抑制OC的分化、成熟及活性，誘導OC的凋亡，從而縮短OC壽命，減少OC數量，抑制骨吸收。2）雌激素通過與ER結合，調節各種細胞因子的分泌，如：OPG、M-CSF等。雌激素還可以負調控炎癥因子（如白細胞介素1、腫瘤壞死因子α的產生，以及上調轉化因子β的表達促進OC的凋亡[19]。

5.12 老年性骨質疏松癥 老年性骨質疏松癥是隨著年齡的增加，體內干細胞向脂肪細胞轉化，OB的成分和功能下降，呈現成纖維細胞的重分化狀態，而OC在多種細胞因子的調控下分化增加，導致骨代謝軸失衡，造成的低轉換型骨質疏松。另外OPGmRNA表達降低和RANKLmRNA表達增高可能是增齡性骨流失的重要原因之一 [20]。通過觀察老年性骨質疏松患者血清細胞因子水平發現，體內的細胞因子通過影響骨髓微環境內OPG/RANKL的比率來調節骨代謝。TNF-α在骨代謝中扮演著重要角色，能夠促進M-CSF和RANKL的表達。TNF-α通過增加M-CSF的受體c-fms在骨髓前體細胞表面的表達來調節骨髓中破骨前體細胞的充裕量 [21]。IFN-γ是OC分化的啟動因子，可以促進組織相容性復合體II類抗原（MHC-II）的表達，進而促進T細胞的增殖與活化，導致RANKL、TNF-α的高表達，致使OC的分化，誘發OP。

5.2繼發性骨質疏松癥

5.21風濕性關節炎（RA） RA是一種常見的慢性全身性炎性疾病，屬于自身免疫性疾病。研究發現，在RA病人病灶部位發現大量OC前體和成熟OC，證明OC與RA密切相關。OC的過度增殖和異常活躍打破骨代謝平衡，使骨吸收占優勢，增加RA的風險。而OPG/RANKL/RANK信號通路可以直接調節OC的功能和活性。Geusens等[22]研究發現RANKL/OPG比值高的RA患者關節破壞程度要明顯高于對照組。Gurban等[23]研究證實RA病人關節中存在sRANKL含量升高和OPG水平下降，可能是RA骨質破壞的分子生物學基礎。此外，OC介導的骨破壞是通過細胞間相互作用和多種細胞因子調控而實現的，炎癥關節產生的促炎因子主要有：IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-11、TNF-α，促炎因子可上調RANKL和RANK水平，促進OC發育，從而加劇骨吸收作用[24]。值得關注的是研究發現IL-6可以通過誘導OB和激活的T細胞表達RANKL來間接促進OC分化和成熟 這可能和風濕性關節炎軟骨退化和關節破壞的發生機制有關[25]。

5.22 糖皮質激素性骨質疏松癥（GIOP）GIOP在藥物導致的骨質疏松癥中最為常見。目前GIOP發病率僅次于絕經后OP和老年性骨質疏松癥，位居第3位。糖皮質激素除了通過促進OB和骨細胞凋亡、降低成骨功能，抑制骨膠原及促進OC生成并延長其生存時間等直接抑制成骨，還可通過調節相關的細胞因子抑制骨局部血流量間接影響骨形成[26]。研究顯示人成骨細胞和骨細胞具有糖皮質激素受體，糖皮質激素可通過受體介導作用直接抑制OB的功能，誘導OB和骨細胞的凋亡，減少骨質的形成。研究發現地塞米松通過下調磷酸化c-Jun蛋白和磷酸化的p46同型Jun N端激酶來下調OB中OPG的表達，同時上調RANKL基因的表達。張彥秋等[27]的實驗動物研究顯示使用高劑量糖皮質激素后RANKL蛋白表達水平明顯升高，OPG蛋白表達水平明顯下降，同時大鼠骨組織中骨小梁紊亂并存在骨折，脂肪細胞空泡變性，骨髓腔水腫，造血細胞稀少，骨小梁周邊OB數量減少，多核OC增多。說明大劑量糖皮質激素誘發了骨質疏松的發生。研究結果表明hRANKL敲除老鼠，通過抑制OPG/RANKL/RANK能防止激素性骨量減少和強度下降。綜上，糖皮質激素不僅能促進OC生成和抑制OPG產生，并且刺激OB譜系產生OPG受體，與RANKL競爭OPG，從而促進骨的吸收導致骨量減少，骨強度降低。

6、OPG/RANKL/RANK信號通路在抗骨質疏松治療藥物中的研究進展

OPG/RANKL/RANK信號通路是調節骨形成和骨吸收的關鍵信號通路，其在調節骨代謝方面的作用使其相關信號分子成為預防和控制OP備受關注的治療靶點。外源性的OPG、Fc-OPG、抗RANKL抗體及RANK-Fc融合蛋白等拮抗劑能夠有效地抑制RANKL對OC的作用。外源性OPG可抑制諸多刺激OC的因素從而抑制動物和人體的各種骨質疏松模型。用重組OPG是提高OPG含量最直接的途徑之一，基因重組OPG應用于卵巢切除小鼠骨質疏松模型，其脛骨骨密度有明顯升高。研究證實重組的OPG與抗體Fc段融合的鑲嵌抗體OPG-Fc，具有抗骨吸收的作用，對OC的發育、分化和存活具有多重效應，能呈劑量依賴性抑制絕經后婦女骨吸收。通過基因轉染技術治療腫瘤和骨吸收等代謝性骨病中骨改建速率有一定的進展，研究證實OPG與RANKL基因轉染技術的應用能顯著增強成骨及骨改建的速率。此外，RANKL全人源單抗denosumab已進入臨床階段，用于低骨量骨質疏松女性，能顯著降低絕經后婦女的骨轉換標志物水平，增加其骨密度。

7、結語

OP及其并發癥給社會帶來了嚴重的精神及經濟負擔，而OP的控制與治療相當有限，故OP的發病機制及防治受到了越來越多的醫生和研究者的關注。OPG/RANKL/RANK信號通路是近幾年骨細胞分子生物學領域最為重要的發現之一，OPG/RANKL/RANK信號通路與OC的分化、活化及成熟之間存在著密切的關系，并且調控著OC骨吸收作用及OB骨形成作用之間的平衡，這為OP提供潛在的以細胞為基礎的治療新途徑。該信號通路的發現不僅闡明了OP的發病機理，而且其在骨骼正常生理活動中扮演著重要的角色，與多種骨疾病密切相關，深入研究此信號通路的調控機制，有助于新藥的研發和治療手段的更新。

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