D-半乳糖衰老小鼠模型的建立

劉佳

【摘? 要】目的：建立 D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型建立。方法：8周齡ICR小鼠，32只，雌性各半，10%D-半乳糖溶液500mg/（kg·d）頸后部皮下注射.連續(xù)注射 56天后后摘眼球取血，頸椎脫臼處死小鼠，并通過(guò)檢測(cè)小鼠血清中 SOD 活力和 MDA 含量，對(duì)此衰老模型做出生物學(xué)鑒定。結(jié)果：造模過(guò)程中模型小鼠逐漸變得不活潑，喜蜷縮，脊椎隆起，體形消瘦，皮膚松弛，毛發(fā)稀疏、豎起失去光澤等一系列衰老體征，而正常對(duì)照組未出現(xiàn)上述衰老體征;與正常對(duì)照組相比，模型組血清SOD活力明顯降低（P<0.01），差異有顯著性意義;與正常對(duì)照組相比，血清MDA含量明顯升高（P<0.01），差異有顯著性意義。結(jié)論：本課題組成功建立了 D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型。

【關(guān)鍵詞】D-半乳糖

【中圖分類(lèi)號(hào)】R764????? 【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A????? 【文章編號(hào)】1672-3783（2019）04-0031-01

【Abstract】Objective：To establish a D - galactose subacute aging mice model.Methods： 8 weeks of ICR mice， 32， female and male in half，500 mg/D - galactose 10% solution （kg·D） at the back of the neck subcutaneous? injection . After 56days continuousinjection，blood were sampled from the eyes ，then the mice were executed.Through testing the SOD activity and MDA contentsin the serum， we can make biology identification of the aging mod.Results：The process of building model ，the model mice gradually became less active，liked curled， the spine upheavaled，body were thin ，skin were loose， hair were sparse，erecting and lost shineetc，a series of signs of aging，.However the normal control group did not appear the aging signs.Compared with the normal control group， the model group serum SOD activity decreased significantly （P < 0.01）;Compared with the normal control group， serum MDA contents increased significantly （P<0.01）.Conclusion：Our research group had established the D-galactose subacute aging model mice sucssessfully

【Key word】D- galactose

有文獻(xiàn)報(bào)道選用D-半乳糖來(lái)建立衰老動(dòng)物模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，雄性大鼠相對(duì)于雌性大鼠更為敏感，可以首選雄性SD大鼠作為動(dòng)物來(lái)源。但亦可選用Wistar大鼠、昆明小鼠、ICR小鼠等。目前D-半乳糖致衰老動(dòng)物模型所需劑量及時(shí)間尚無(wú)統(tǒng)一規(guī)定，劑量范圍從50-1250mg/（kg·d）不等。有學(xué)者認(rèn)為，在制備D-半乳糖衰老大鼠或小鼠模型時(shí)，給D-半乳糖 50-500mg/（kg·d），連續(xù)6-8周比較合適。

本課題組選擇ICR小鼠，D-半乳糖500 mg/（kg·d），建立衰老動(dòng)物模型，通過(guò)觀察各組小鼠生命狀態(tài)的變化，及血液相關(guān)生化指標(biāo)，判斷此方法是否可以成功建立衰老模型。

1 材料

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

8周齡ICR小鼠，雌雄各半，32只，體重25～30g，購(gòu)自北京動(dòng)物維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，許可證號(hào)：SCXK（京）2012-0001，實(shí)驗(yàn)過(guò)程中對(duì)動(dòng)物的處置符合倫理學(xué)標(biāo)準(zhǔn)。

2 方法

2.1 動(dòng)物的分組及飼養(yǎng)

32只8周齡ICR小鼠（25～30 g），雌雄各半，隨機(jī)分成正常對(duì)照組、模型組每組16只，SPF級(jí)飼養(yǎng)。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程小鼠自由進(jìn)食、飲水，飼料和水需經(jīng)過(guò)滅菌。

2.2 D-半乳糖模型的建立

每周稱(chēng)重一次，依據(jù)體重頸背部皮下注射 5% D-半乳糖溶液500mg/kg﹒bw，每天早上 9：00 注射一次，連續(xù)注射56天。正常對(duì)照組小鼠注射以相同劑量的生理鹽水。在建模期間觀察記錄小鼠的生存狀態(tài)和生物學(xué)行為的動(dòng)態(tài)變化并定期稱(chēng)量其體質(zhì)量。

2.3小鼠形態(tài)特征的觀察及血液標(biāo)本的收集

造模期間逐日觀察小鼠生存狀態(tài)及形態(tài)特征的變化，最后一次給藥2 h后用眼科鑷摘眼球取血，放入標(biāo)記好的EP管中，離心3500轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，取上清于新的 EP 管中，做好標(biāo)記，然后放入-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4小鼠血清中總 SOD 活力、MDA的測(cè)定

SOD的抑制率（%）=（A對(duì)照-A對(duì)照空白）-（A測(cè)定-A測(cè)定空白）/（A對(duì)照-A對(duì)照空白）

SOD活力=SOD抑制率÷50%×反應(yīng)體系稀釋倍數(shù)（0.24ml/0.02ml）×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

血清中 MDA 含量計(jì)算公式為：MDA 含量（nmol/mL）=（測(cè)定管吸光度值-測(cè)定空白管吸光度值）/（標(biāo)準(zhǔn)管吸光度值-標(biāo)準(zhǔn)空白管吸光度值）×標(biāo)準(zhǔn)品濃度（10 nmol/mL）×樣本測(cè)試前稀釋倍數(shù)

計(jì)算出 MDA 含量后換算成國(guó)際單位（?mol/L），進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2.5統(tǒng)計(jì)方法

統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用 SPSS18.0 軟件，數(shù)據(jù)用表示，組間采用t檢驗(yàn)。P<0.05 表示組間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

3 結(jié)果

3.1小鼠生存狀態(tài)變化

造模過(guò)程中兩組小鼠均無(wú)出現(xiàn)死亡，模型組小鼠脊椎逐漸隆起，體形消瘦，皮膚松弛，毛發(fā)逐漸失去光澤，蓬松直豎并且變得稀疏，行動(dòng)遲緩，少動(dòng)，喜蜷縮;對(duì)照組小鼠則無(wú)相應(yīng)形態(tài)變化。

3.2小鼠血清SOD活力及MDA含量測(cè)定

與正常對(duì)照組相比，模型組血清SOD活力明顯降低（P<0.01），差異有顯著性意義;與正常對(duì)照組相比，血清MDA含量明顯升高（P<0.01），差異有顯著性意義。

4 討論

衰老的代謝學(xué)說(shuō)，即自由基學(xué)說(shuō)，認(rèn)為新陳代謝是生命的本質(zhì)，也是生命活動(dòng)得以維持的基礎(chǔ)，機(jī)體的衰老是由新陳代謝障礙引起的^[1]。在三大類(lèi)物質(zhì)代謝中，糖類(lèi)代謝途徑處于核心地位，對(duì)整個(gè)有機(jī)體新陳代謝的正常進(jìn)行有重要意義。糖類(lèi)代謝紊亂必將引起心、肝、腦、腎等重要器官代謝活動(dòng)的異常，最終引發(fā)機(jī)體的衰老^[2]。D-半乳糖衰老小鼠模型自1991年首次提出以來(lái)在國(guó)內(nèi)得到廣泛運(yùn)用和發(fā)展。相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道發(fā)現(xiàn)該模型表現(xiàn)出與16～24月齡衰老鼠相似的學(xué)習(xí)記憶能力下降，自由基產(chǎn)生增加，抗氧化物酶活性降低，免疫功能退化等自然衰老過(guò)程中的變化^[3]。D-半乳糖在半乳糖氧化酶的作用下生成乙醛糖和過(guò)氧化氫，使活性氧增多，脂質(zhì)過(guò)氧化亢進(jìn)，產(chǎn)生超氧陰離子自由基，這些活性氧成分可以降低體內(nèi) SOD、CAT、GSH-PX 等自由基清除系統(tǒng)的活力，進(jìn)一步加劇體內(nèi)自由基的積累，引起機(jī)體一系列機(jī)能的損傷。同時(shí)，過(guò)量的自由基使生物膜脂質(zhì)雙分子層中的不飽和脂肪酸過(guò)氧化，而形成脂質(zhì)過(guò)氧化物丙二醛MDA。脂質(zhì)過(guò)氧化物的代謝產(chǎn)物進(jìn)一步與磷脂酰乙醇胺和蛋白質(zhì)交聯(lián)，生成無(wú)活性脂褐質(zhì)，沉積于組織細(xì)胞，破壞細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，最后導(dǎo)致細(xì)胞無(wú)法維持正常代謝而死亡。在衰老現(xiàn)象中以機(jī)體生命形態(tài)特征的改變和體內(nèi)活性氧的積累最為典型，常用這些指標(biāo)作為評(píng)價(jià)衰老模型建立成功與否的標(biāo)準(zhǔn)。SOD是消除自由基的酶系防御體系，MDA的生成量可以反映氧化程度的高低，目前以這兩種指標(biāo)對(duì)D-半乳糖致衰老模型建立做鑒定^[4，5]。有實(shí)驗(yàn)證實(shí)，D-半乳糖可引起體內(nèi)自由基生成增多^[42]，血液總抗氧化活力下降，SOD和GSH-PX含量降低，MDA水平增高。

本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠脊椎逐漸隆起，體形變得消瘦，毛發(fā)灰黃色、蓬松、稀疏，失去光澤，皮膚松弛，行動(dòng)遲緩，少動(dòng)。這些形態(tài)特征的變化與自然衰老小鼠相一致，也與相關(guān)文獻(xiàn)中報(bào)道的 D-半乳糖亞急性衰老小鼠形態(tài)特征的改變相一致^[6]。本實(shí)驗(yàn)中模型組小鼠 SOD 活力下降，MDA 含量升高說(shuō)明模型小鼠體內(nèi)自由基含量升高，同時(shí)體內(nèi)自由基的清除能力下降，這與自然衰老小鼠體內(nèi)生化指標(biāo)的改變相一致^[7]。綜合這兩個(gè)方面，說(shuō)明本實(shí)驗(yàn)所建立的 D-半乳糖亞急性衰老小鼠模型具有較高的可靠性。

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