西藏熱泉1株產纖維素酶真菌的鑒定及產酶條件優化

盧雨欣，趙航軻，唐小飛，劉開輝,2，鄧百萬,3，丁小維,2

(1.陜西理工大學 生物科學與工程學院，陜西 漢中 723000；2.陜西科技大學 食品與生物工程學院，陜西 西安 710021； 3.陜西省食藥用菌工程技術研究中心，陜西 漢中 723000)

纖維素是世界上較豐富、分布較廣的可再生生物質資源，每年的生成量高達1.0×1011t，相當于年消耗生物資源的20多倍[1-4]。粗略估計，世界范圍內有89%的植物生物質資源未被利用[5]，通常作焚燒處理，進而造成了資源的大量浪費及各種環境問題[6-7]。纖維素主要依賴于羧甲基纖維素酶進行水解[8-9]。由于真菌分離的纖維素酶具有酶系統完整、易于純化的優點，目前的研究對象主要集中于真菌產纖維素酶[10]。然而大部分產纖維素酶真菌不具耐高溫等特點，嚴重制約了其在生產上的應用。因嗜熱真菌在高溫環境下仍可產生纖維素酶，已經成為研究中的熱點。

嗜熱真菌是一類特殊的真菌，其生長溫度最低20 ℃，最高50 ℃[11]。主要存在于溫泉、堆肥、火山等各種高溫環境，且這些特殊的環境使得嗜熱真菌對高溫表現出較強的適應能力，形成了特殊的代謝機制。嗜熱真菌所產的酶通常更具有耐熱性，甚至在高溫下依然能保留部分活性，具有生產應用潛力[12]。其中，嗜熱纖維素酶在食品[13]、釀酒[14]、紡織洗滌[15]、農業和環境保護[16]等方面得到了廣泛應用。目前，國內外報道的產纖維素酶嗜熱真菌僅有ThermotogamaritimeMSB8[17]、Thermotoganeapolitana[18]、AspergillusfumigatusZ5[19]、Gladaxporismsp.SCSIO 43503[20]等。鑒于此，本研究從西藏尼木熱泉沉積物中篩選具有產纖維素酶能力的嗜熱真菌，對其產酶培養基及發酵條件進行初步優化，為后續嗜熱纖維素酶資源的開發利用奠定基礎。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 從西藏尼木熱泉沉積物中分離得到的1株嗜熱真菌。

1.1.2 培養基 剛果紅培養基[21]：(NH4)2SO42.0 g/L、K2HPO41.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L、NaCl 0.5 g/L、羧甲基纖維素鈉2.0 g/L、剛果紅0.4 g/L、瓊脂22.0 g/L，pH值自然；PDA培養基：去皮馬鈴薯200.0 g/L、葡萄糖20.0 g/L、瓊脂18.0 g/L，pH值自然；基礎發酵培養基：羧甲基纖維素鈉20.0 g/L、蛋白胨6.0 g/L、K2HPO42.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.5 g/L，pH值自然。

1.2 方法

1.2.1 菌株篩選 嗜熱真菌在45 ℃下培養，觀察剛果紅培養基上透明圈大小，初步判斷產酶活性。

1.2.2 菌株鑒定 將篩選所得的產纖維素酶菌株接種于PDA培養基，在45 ℃下培養，觀察其形態特征。同時采用插片法觀察其顯微形態，結合參考文獻[22]進行初步鑒定。

利用CTAB[23]法提取真菌DNA，真菌引物(ITS1/ITS4)進行PCR擴增。擴增產物送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。所得序列在NCBI中進行比對，利用Mega 7軟件進行鄰接(NJ)樹的構建。

1.2.3 纖維素酶活力測定 葡萄糖標準曲線(Y=0.412 5X+0.045 8，R2= 0.999 8)參照文獻[24]進行繪制。其中，Y代表葡萄糖含量，X代表酶解反應產物顯色后的吸光值。

纖維素酶活力測定[25]：將粗酶液進行適當稀釋，取0.5 mL加1.5 mL 0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，50 ℃水浴30 min，加入二硝基水楊酸(DNS)試劑3 mL終止反應，沸水浴5 min，冷卻定容，測OD540值。酶活力單位：該條件下1 mL酶液水解1 min生成1 μg葡萄糖的酶量(U/mL)。

1.2.4 產纖維素酶菌株培養基組分的優化 菌株活化：將斜面菌株接種至PDA培養基上，45 ℃培養5 d。

碳源篩選：將活化菌株取0.5 mm2小塊分別接種至用淀粉、乳糖、玉米芯粉、稻草粉替代羧甲基纖維素鈉的基礎發酵培養基中，各組分含量不變，45 ℃、150 r/min發酵3 d，測定纖維素酶活力，篩選最佳碳源，并進一步篩選出最適含量。

氮源篩選：將活化菌株取0.5 mm2小塊分別接種至用酵母粉、NH4Cl、NH4NO3和(NH4)2SO4替代蛋白胨的基礎發酵培養基中，各組分含量不變，45 ℃、150 r/min發酵3 d，測定纖維素酶活力，篩選出最佳氮源，并進一步篩選出最適含量。

正交法優化培養基組分：在單因素基礎上，以乳糖(A)、(NH4)2SO4(B)、K2HPO4(C)、MgSO4·7H2O(D)作為 4個影響產纖維素酶培養基組分的因素，正交試驗方案如表1所示。

表1 產纖維素酶菌株培養基組分優化的正交試驗方案Tab.1 Orthogonal experimental design for optimal medium of cellulase producing strain g/L

1.2.5 產纖維素酶菌株發酵條件的優化 選取發酵溫度(41、45、49、53、57、59 ℃)、起始pH值(4.5、5.5、6.5、7.5、8.5)、發酵時間(2、3、4、5、6、7 d)，檢測各因素對菌株產纖維素酶活力的影響，初步確定發酵條件。

正交法優化發酵條件：在單因素基礎上，以發酵溫度(A)、起始pH值(B)、發酵時間(C)作為3個影響產纖維素酶發酵條件的因素，設計三因素三水平正交試驗方案，如表2所示。

表2 產纖維素酶菌株發酵條件優化的正交試驗方案Tab.2 Orthogonal experimental design for optimal fermentation condition of cellulase producing strain

1.2.6 數據分析 采用SPSS 22.0進行數據分析。

2 結果與分析

2.1 產纖維素酶菌株的篩選及鑒定

2.1.1 產纖維素酶菌株的篩選 菌株THN8在剛果紅培養基上的透明圈直徑為30 mm，菌落直徑為6 mm，直徑差為24 mm(圖1)。

圖1 產纖維素酶菌株THN8的篩選Fig.1 Screening of cellulase producing strain THN8

2.1.2 菌株形態特征 菌株THN8于45 ℃下在PDA培養基上生長迅速，3 d滿皿，菌絲纖細、白色似網狀，粗壯菌絲偶有螺旋環狀形成，且表面濕潤(圖2A)；觀察顯微形態發現，菌絲分枝無隔，在菌絲頂端或中部膨大形成卵圓形產孢結構，并有淺層氣生菌絲附著表面(圖2B)，與JATINDER等[22]所描述的Melanocarpussp.形態特征相似。因此，該菌株初步被鑒定為Melanocarpussp.。

A：菌落形態； B：顯微形態A:Strain colony morphology； B:Microscopic morphology圖2 菌株THN8的形態特征Fig.2 Morphological characteristics of strain THN8

2.1.3 菌株系統發育分析 將菌株THN8所測得序列與NCBI數據庫進行比對，其與Melanocarpusalbomyces(NR145150)和Melanocarpusalbomyces(KX976679)序列的相似性≥99%，且在系統發育樹中與Melanocarpusalbomyces聚于同一個分支上，其自展支持率為100%。因此，該菌株被鑒定為Melanocarpusalbomyces(圖3)。

圖3 菌株THN8的ITS序列系統發育樹Fig.3 ITS phylogenetic tree of strain THN8

2.2 菌株THN8培養基組分優化

2.2.1 碳源 5種供試碳源均能誘導菌株THN8產生纖維素酶(圖4)，其中，以乳糖為唯一碳源時，菌株THN8產纖維素酶活力最高，為3.8 U/mL，所以確定乳糖為最佳碳源。乳糖的最適質量濃度為90 g/L(圖5)。

圖4 不同碳源對菌株THN8產纖維素酶活力的影響Fig.4 Effects of different carbon sources on cellulase activity of strain THN8

圖5 不同乳糖含量對菌株THN8產纖維素酶活力的影響Fig.5 Effects of different lactose contents on cellulase activity of strain THN8

2.2.2 氮源 5種供試氮源均能誘導菌株THN8產生纖維素酶(圖6)，其中，以(NH4)2SO4為唯一氮源時，菌株THN8產纖維素酶活力最高，為4.2 U/mL，所以確定(NH4)2SO4為最佳氮源，其最適質量濃度為6 g/L(圖7)。

2.2.3 菌株THN8產纖維素酶培養基組分的正交試驗優化 由表3中R值(極差)可知，乳糖(A)、(NH4)2SO4(B)、K2HPO4(C)、MgSO4·7H2O(D) 4個因素對產纖維素酶活力影響的大小順序為A>B>C=D，但B與C、D基本接近。正交試驗表明，最佳產纖維素酶培養基方案為A3B2C3D3。對表3中各因素進行方差分析， 如表4所示，4個因素均達到極顯著水平，其對產酶活力影響的大小順序為，A>B>D>C，因素A對產纖維素酶活力影響最大，因素B、C、D基本接近，與極差分析結果基本一致。因此確定最佳配方為乳糖 92.0 g/L、(NH4)2SO46.0 g/L、K2HPO43.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.55 g/L。

圖6 不同氮源對菌株THN8產纖維素酶活力的影響Fig.6 Effects of different nitrogen sources on cellulase activity of strain THN8

圖7 不同(NH4)2SO4含量對菌株THN8產纖維素酶活力的影響Fig.7 Effects of different (NH4)2SO4 contents on cellulase activity of strain THN8

2.3 菌株THN8發酵條件優化

2.3.1 發酵溫度 由圖8可知，菌株THN8產纖維素酶活力在發酵溫度41～57 ℃時處于逐步上升狀態，在57 ℃時，菌株THN8產纖維素酶活力達到最大，為25.8 U/mL，此后開始下降。因此，發酵溫度初步確定為57 ℃。

2.3.2 起始pH值 由圖9可知，菌株THN8產纖維素酶活力在起始pH值 4.5～5.5時處于上升狀態，在起始pH值為5.5時，菌株THN8產纖維素酶活力達到最高，為22.6 U/mL，此后持續下降。因此，起始pH值初步確定為5.5。

表3 菌株THN8產纖維素酶培養基組分優化正交試驗結果Tab.3 Orthogonal experimental results for optimal medium of cellulase producing strain THN8

表4 菌株THN8產纖維素酶培養基組分優化正交試驗的方差分析Tab.4 Analysis of variance of orthogonal experiment for optimal medium of cellulase producing strain THN8

注：**表示該因素的影響達到極顯著水平(P<0.01)，*表示該因素的影響達到顯著水平(P<0.05)，下同。

Note :** indicate the influence of this factor is extremely significant(P<0.01),and * indicate the influence of this factor is significant(P<0.05),the same below.

圖8 不同發酵溫度對菌株THN8產纖維素酶活力的影響Fig.8 Effects of different temperature on cellulase activity of strain THN8

圖9 不同起始pH值對菌株THN8產纖維素酶活力的影響Fig.9 Effects of different initial pH value on cellulase activity of strain THN8

2.3.3 發酵時間 由圖10可知，菌株THN8產纖維素酶活力在發酵2～5 d時處于穩步上升狀態，在發酵5 d時，菌株THN8產纖維素酶活力達到最高，為23.9 U/mL，發酵5～7 d時，菌株THN8產纖維素酶活力下降后又趨于保持平穩。因此，發酵時間初步確定為5 d。

2.3.4 菌株THN8產纖維素酶發酵條件的正交試驗優化 由表5中R值可知，發酵溫度(A)、起始pH值(B)、發酵時間(C)3個因素對產酶活力影響的大小順序為A>B>C。正交試驗表明：3個因素的最佳水平組合為A3B2C1，在該組合條件下，產纖維素酶活力最高，為28.1 U/mL。對表5中各因素進行方差分析，結果如表6所示，3個因素對產纖維素酶活力影響的大小順序為A>B>C，與極差分析結果一致。因此，最終確定菌株THN8產纖維素酶發酵條件的最佳組合為發酵溫度58 ℃、起始pH值 5.5、發酵時間4 d。

圖10 不同發酵時間對菌株THN8產纖維素酶活力的影響Fig.10 Effects of different fermentation time on cellulase activity of strain THN8

表5 菌株THN8產纖維素酶發酵條件優化正交試驗結果Tab.5 Orthogonal experimental results for optimal ferme-ntation condition of cellulase producing strain THN8

表6 菌株THN8產纖維素酶發酵條件優化正交試驗的方差分析Tab.6 Analysis of variance of orthogonal experiment for optimal fermentation condition of cellulase producing strain THN8

3 結論與討論

本研究從西藏尼木熱泉嗜熱真菌中篩選出1株產纖維素酶菌株THN8，根據形態學和ITS序列分析將該菌株鑒定為Melanocarpusalbomyces。菌株產纖維素酶的最佳培養基配方為乳糖 92.0 g/L、(NH4)2SO46.0 g/L、K2HPO43.0 g/L、MgSO4·7H2O 0.55 g/L，最佳發酵條件為發酵溫度58 ℃、起始pH值5.5、發酵時間4 d，在該條件下菌株THN8產纖維素酶活力為28.1 U/mL。

產纖維素酶嗜熱真菌與一般真菌相比，其在高溫發酵過程中纖維素酶活力較穩定或下降較慢，同時較高的溫度也可在發酵過程中降低污染，因此嗜熱真菌產纖維素酶可以在生產中廣泛應用。金偉等[26]從土壤中分離出耐熱煙曲霉XT3，產纖維素酶活力為3.836 U/mL；嚴芬等[27]從造紙廠污泥中篩選出土曲霉XM5，產纖維素酶活力為4.3 U/mL；趙旭等[28]從雙孢菇培養料中分離篩選得到降解纖維素的耐高溫芽孢桿菌屬菌株X3，產纖維素酶活力為20.36 U/mL。本研究從西藏尼木熱泉中分離得到的產纖維素酶嗜熱真菌THN8，通過培養基及發酵條件優化，其產纖維素酶活力達到28.1 U/mL，與上述報道的菌株相比，菌株THN8產纖維素酶活力更高，熱穩定性更好，在生產中具有廣闊的應用潛力，可以在降解利用纖維素類農業廢棄物方面進一步開發利用。