菌株Enterobacter sp.降解除草劑阿特拉津產物測定及降解基因克隆

劉丹丹，孫宛玉，劉 暢，馬浩珂，王瑞嬌，隋宇凡

(沈陽化工大學 環境與安全工程學院，遼寧 沈陽 110142)

在農業生產領域，三嗪類除草劑阿特拉津以顯著的效果和低廉的價格，成為世界上應用最廣的除草劑之一[1]。其常用于玉米、高粱、甘蔗等闊葉雜草和1年生禾本科雜草的防治[2-3]，但長期、大面積施用會對生態系統造成破壞。研究表明，阿特拉津是潛在的內分泌干擾物，會增加乳腺癌和纖維瘤發病率，造成兩棲動物及哺乳動物的出生缺陷、生長影響、免疫系統損傷、中樞神經和心血管功能受損等[4-5]。因此，對于包括中國在內，仍在大面積使用阿特拉津的國家而言，解決其污染問題刻不容緩。

目前降解阿特拉津有水解、光解及生物降解等方式。自Wackeet 實驗室分離出能夠完全降解阿特拉津的菌株Pseudomonassp.至今[6]，大量功能性的微生物逐漸被人們所認識。綜合近年來研究發現，農藥的生物降解憑借高效、無二次污染、經濟、操作簡單等優勢被廣泛應用[7]。例如Alcaligenes、Pseudaminobacter、Ralstonia、Nocardioides、Arthrobacter等細菌被報道有降解阿特拉津的能力，并攜帶atzABCDEF或trzDFN降解基因，這2種降解基因有助于阿特拉津的礦化[8]。

試驗表明，菌株Enterobactersp.對阿特拉津的降解能力超過90%[9]。鑒于此，本研究在前期工作基礎上，以菌株Enterobactersp.為研究對象，利用液相色譜與質譜聯用技術檢測阿特拉津降解過程產生的關鍵代謝產物，并通過PCR擴增技術及GO功能富集分析對降解基因進行篩選和克隆,進一步探究阿特拉津降解途徑。

1 材料和方法

1.1 供試菌株

以前期試驗分離獲得的阿特拉津降解菌株Enterobactersp.為研究對象，其存放于沈陽化工大學環境科學實驗室。

1.2 試劑

無機鹽培養基：磷酸氫二鉀1.6 g、磷酸二氫鉀0.4 g、七水硫酸鎂0.4 g、氯化鈉0.1 g、葡萄糖3 g、阿特拉津0.1 g，用蒸餾水定容至1 000 mL，pH值調至中性，121 ℃高壓滅菌30 min[10]。以上所用試劑均為分析純。阿特拉津(純度約99.9%)、羥基阿特拉津(純度>99%)、氰尿酸(純度>99%)，均購自上海西格瑪公司。尿素(純度>99%)購自天津市大茂化學試劑廠。

1.3 阿特拉津降解率的測定

樣品預處理：將菌株Enterobactersp.在含有100 mg/L阿特拉津的無機鹽培養基中培養120 h。用等體積CHCl3和適量的NaCl溶液萃取[10]，取下層有機相，用旋轉蒸發器于45 ℃濃縮，用甲醇定容到1 mL。

采用液相色譜法測定阿特拉津的殘留量。檢測條件為C18反相硅膠色譜柱(柱長250 mm×內徑4.6 mm)，甲醇與水(V/V=80/20)為流動相，流速為1 mL/min，柱溫25 ℃，進樣量5 μL，檢測波長213 nm[10]。阿特拉津降解率的計算參考YANG等[11]的公式:

式中，X為阿特拉津降解率，CX為阿特拉津的最終含量(mg/L)，CCK為阿特拉津的原始含量(mg/L)。

1.4 阿特拉津降解產物測定

采用液相色譜與質譜聯用技術測定阿特拉津降解產物。進樣前處理方法參照1.3中描述，降解產物經旋轉蒸發器濃縮后，加入500 μL甲醇溶解，渦旋混勻后14 000 r/min離心10 min，取上清100 μL進樣[12-14]。流動相梯度如表1所示。

表1 流動相梯度Tab.1 Mobile phase gradient

1.4.1 羥基阿特拉津 液相色譜：色譜柱Thermo Accucore C18(柱長100 mm×內徑2.1 mm，粒徑2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃。

質譜：電噴霧-正離子模式(SRM)，參數：毛細管溫度300 ℃，氣化器溫度400 ℃，鞘氣壓力10 kPa，輔助氣壓力2 kPa，噴霧電壓3 000 V(+)/4 000 V(-)。

1.4.2 氰尿酸 液相色譜：色譜柱Thermo Accucore C18(柱長100 mm×內徑2.1 mm，粒徑2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃。

質譜：電噴霧電離-負離子模式(SIM-Q1MS)，參數：毛細管溫度 270 ℃，氣化器溫度 400 ℃，鞘氣壓力20 kPa，輔助氣壓力5 kPa，噴霧電壓 5 000 V(+)/4 000V(-)。

1.4.3 尿素 液相色譜：色譜柱Thermo Accucore C18(柱長100 mm×內徑2.1 mm，粒徑2.6 μm)，流速0.2 mL/min，柱溫30 ℃。

質譜：電噴霧電離-正離子模式(SRM)，參數：毛細管溫度252 ℃，氣化器溫度300 ℃，鞘氣壓力10 kPa，輔助氣壓力2 kPa，噴霧電壓4 500 V(+)/4 000 V(-)。

1.5 阿特拉津降解基因的篩選與克隆

參考前期降解基因轉錄組測序結果進行分析和比較，篩選出6個與阿特拉津降解有關的基因，分別為L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA[9]。各基因產物及位置等信息見表2。

表2 阿特拉津降解基因Tab.2 Atrazine degradation gene

采用PCR擴增技術對阿特拉津降解基因進行克隆。細菌總DNA提取采用CTAB法[15]。反應體系為50 μL，其中包括引物(表3)5 μL、DNA模板1 μL、dNTPs 5 μL、TaqDNA聚合酶0.5 μL、緩沖液5 μL、雙蒸水33.5 μL。

PCR反應條件為：94 ℃，預變性5 min，設35個循環(94 ℃變性40 s，58 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min)，在此基礎上72 ℃延伸10 min，4 ℃穩定4 min。

用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產物，EB(溴化乙錠)染色10 min，凝膠圖像系統(上海天能科技有限公司)觀察目標條帶。采用TIAN rapid Midi Purification試劑盒(天根生物科技有限公司)回收目標條帶，送至金唯智生物科技有限公司進行測序。

1.6 阿特拉津降解基因GO功能富集分析

對篩選出的降解基因進行GO功能富集分析，結合GO注釋結果推測降解基因的功能。

表3 降解基因的引物名稱及序列 Tab.3 Primer names and sequences of degrading genes

2 結果與分析

2.1 阿特拉津降解率與降解產物的測定結果

經液相色譜與質譜聯用技術測定菌株Enterobactersp.在48 h內降解率高于90%，是理想的高效降解菌株[9]。降解阿特拉津120 h后的關鍵中間代謝產物為羥基阿特拉津、氰尿酸以及尿素。待測樣本運行9 min，出峰時間為4.75 min，離子質荷比為156.1 m/z(圖1、2)，成功檢測出羥基阿特拉津。待測樣本運行5 min，出峰時間為1.07 min，離子質荷比為128.0 m/z(圖3、4)，成功檢測出氰尿酸。待測樣本運行9 min，出峰時間為0.26 min(圖5)，離子質荷比為44.5 m/z，如(圖6)，成功檢測出尿素。

圖1 羥基阿特拉津總離子圖譜Fig.1 Total ion map of hydroxyatrazine

圖2 羥基阿特拉津質譜圖Fig.2 Mass spectrogram of hydroxyatrazine

圖3 氰尿酸質譜圖 Fig.3 Mass spectrogram of cyanuric acid

圖4 氰尿酸總離子圖譜Fig.4 Total ion map of cyanuric acid

圖5 尿素總離子圖譜Fig.5 Total ion map of urea

圖6 尿素質譜圖 Fig.6 Mass spectrogram of urea

2.2 阿特拉津降解基因的測定結果

通過GO富集分析降解基因L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA，更好地了解降解基因相關的生物學功能。并結合PCR擴增技術，先后擴增出長度為1 020 bp的α/β水解酶基因L465-RS09425、長度為1 080 bp的單加氧酶基因L465-RS10465、長度為1 380 bp的鳥嘌呤脫氨酶基因L465-RS12445、長度為900 bp的MBL折疊金屬水解酶基因L465-RS09100、長度為480 bp的嘧啶利用蛋白基因L465-RS12200和長度為360 bp的脲酶基因UreA(圖7)。

圖7 阿特拉津降解基因PCR擴增產物電泳圖譜Fig.7 Electrophoresis map of amplified products of atrazine degrading genes by PCR

2.3 阿特拉津的降解途徑分析

結合各阿特拉津降解基因的作用(表4)，初步分析阿特拉津降解途徑可能為圖8所示。在降解產物中檢測到羥基阿特拉津、氰尿酸、尿素,可以推測具體降解過程可能為，在基因L465-RS09425作用下發生水解反應，阿特拉津脫氯為羥基阿特拉津，該水解酶基因功能與前人發現的AtzA、TrzN基因功能相似[16-21]；羥基阿特拉津經基因L465-RS10465作用，連續脫2次烷基，轉化為氰尿酸二酰胺，這一作用基因與前人發現的AtzB基因的功能相似[22]；在基因L465-RS12445的作用下發生脫氨基反應生成氰尿酸；氰尿酸在基因L465-RS09100作用下開環產生脲基二甲酸；隨后嘧啶利用蛋白基因L465-RS12200使脲基二甲酸發生脫羧反應進而生成下一

表4 阿特拉津降解基因GO富集分析Tab.4 GO enrichment analysis of atrazine degrading genes

階段的產物——尿素；最后，尿素在尿酶輔助蛋白基因UreA的作用下生成CO2、H2O和NH3。在目前已知的降解菌株中，只有少部分能將阿特拉津完全降

解為NH3、H2O和CO2[20-21]，大部微生物只能將其轉化為中間代謝產物，如羥基阿特拉津[23-24]、氰尿酸[25-27]、縮二脲、乙酰胺等。

圖8 阿特拉津降解途徑 Fig.8 Atrazine degradation pathway

3 結論與討論

隨著研究的深入，發現菌株Enterobactersp.降解阿特拉津的過程與王輝等[28]總結的阿特拉津微生物代謝過程不同。這是因為，微生物的代謝方式是多樣的，相同微生物作用同一底物，會存在多條代謝路徑，正是這一特點奠定了微生物強大的環境適應能力[29]。這與細菌環境適應性強、具有多樣化的代謝方式相符合，更利于生物功能進化。本研究通過液相色譜與質譜聯用技術檢測阿特拉津降解產物，并用PCR技術對基因克隆，同時進行基因功能比對，推測出其降解路徑。當阿特拉津降解時，菌株Enterobactersp.在L465-RS09425、L465-RS10465、L465-RS12445、L465-RS09100、L465-RS12200和UreA共6種基因控制的α/β水解酶、烷烴1-單加氧酶、鳥嘌呤脫氨酶、MBL金屬水解酶、嘧啶利用蛋白C、脲酶亞單位γ作用下，先后生成了羥基阿特拉津、氰尿酸二酰胺、氰尿酸、脲基二甲酸和尿素5種中間體。在試驗中得知，菌株Enterobactersp.為革蘭氏陰性菌，可以將阿特拉津完全礦化[30]。初步推測菌株Enterobactersp.在降解基因的作用下，經脫氯、脫烷基、脫氨基、環裂解、脫羧和脲基甲酸水解等過程，將阿特拉津逐步礦化。菌株Enterobactersp.可以將阿特拉津完全礦化為NH3、H2O和CO2。有關新基因的功能分析，還需要進一步采用基因敲除和降解率測定等方法進行功能驗證。