高粱TCP基因家族全基因組鑒定及表達分析

鄭 玲，白雪婷，李會云

(洛陽師范學院 生命科學學院，河南 洛陽 471934)

TCP基因是3個不同物種的4個基因的縮寫，分別是玉米中的TB1(Teosinte branched 1)基因，金魚草中的CYC(Cycloidea)基因和水稻中的PCF1(Proliferating cell factors 1)和PCF2基因[1-3]。TCP是植物特有的轉錄因子家族，大多數TCP蛋白在N端有1段約60個氨基酸殘基組成的與DNA結合的非典型bHLH(Basic-helix-loop-helix)保守區，又稱為TCP結構域。此外，TCP蛋白還存在1個保守的R結構域，R結構域并不是所有的TCP轉錄因子共有的，它富含精氨酸、賴氨酸和谷氨酸等極性氨基酸，可以形成1個親水性的ɑ螺旋[2，4]。

根據TCP基因家族結構域同源性，可將TCP基因家族分為ClassⅠ和ClassⅡ 2個類群。ClassⅡ的TCP結構域比ClassⅠ多了4個氨基酸殘基[1]。ClassⅠ中最先確定的功能基因是水稻的PCF1和PCF2，因此，TCP ClassⅠ也被稱為PCF(或TCP-P)[5]。研究發現，擬南芥AtTCP14基因參與調控種子的胚胎發育[6]；AtTCP15基因不僅參與節間長度調控，還與葉片發育調控有關[7]；AtTCP20基因參與調控植物生長發育、茉莉酸(JA)生物合成及葉片衰老[8-9]；AtTCP22基因在葉片衰老中起負調控作用，并與AtTCP15基因存在功能冗余現象[10]；AtTCP16基因在發育的小孢子中表達，在轉基因植株中下調該基因可導致1/2的花粉異常[11]；AtTCP11基因與維管束后生木質部導管分子的分化和形成有關[12]；AtTCP17基因參與光信號傳導和生長素合成從而調節細胞伸長[13]。

ClassⅡ類(TCP-C)[7]成員又可分為CYC/TB1和CIN (Cincinnata)2個亞類，CYC/TB1亞類中包含1段非保守的谷氨酸-半胱氨酸-谷氨酸的延伸結構[14]；CIN亞類中包含有microRNA miR-319的靶基因[15]。CIN亞類起源于金魚草(Antirrhinum)中的CINCINNATA，包含涉及側生器官發育的基因；而CYC/TB1亞類(或ECE亞類)包含腋分生組織發育成花或側枝的基因[16]。研究發現，玉米TB1基因是玉米頂端優勢的決定因素之一，此外，TB1基因還參與調控玉米葉分生組織的分化，防止在低節點生成芽以及在高節點上生成雌花序[16]；水稻TB1基因也參與調控水稻側枝發育[17]；TB1與其同源基因(AtTCP12、AtTCP18、SlTCP7、SlTCP9)都在腋芽中表達，調控側生器官發育[18]。

高粱(SorghumbicolorL.)是禾本科高粱屬植物，葉和玉米葉很像，具有圓錐形花序和紅褐色籽粒。高粱是我國的重要經濟作物之一，其籽粒是釀造茅臺、竹葉青等諸多名酒的主要原材料，在未來的生物能源中也將發揮重要作用[19]。近年來，由于人們發現TCP基因在植物生長發育過程中起著重要的調控作用，其家族成員的全基因組鑒定和分析成為研究熱點，目前已在多個物種中進行了研究，如大豆[20]、辣椒[21]、毛竹[22]、擬南芥[23]、番茄[24]、玉米[25]等，還未見關于高粱TCP 基因家族全基因組鑒定和分析的報道。為此，對高粱TCP家族基因進行鑒定和分析，并推測高粱TCP家族部分基因的功能，分析高粱TCP基因在不同器官和非生物脅迫下的表達情況，旨在為進一步研究TCP基因在高粱生長發育及逆境脅迫中的作用提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

高粱的TCP序列來自PlantTFDB(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)、Phytozome(http://phytozome.net/)數據庫，擬南芥(Arabidopsisthaliana)TCP基因序列來自PlantTFDB網站； TCP基因在高粱各組織中的表達量數據來自qTeller(http://qteller.com/)網站。

1.2 試驗方法

1.2.1 高粱TCP基因家族成員的鑒定 從Pfam 網站(http://pfam. sanger.ac.uk/)下載TCP基因家族種子序列(PF03634),并以PF03634為搜索序列在Phytozome數據庫(http://phytozome.net/)中下載全部高粱TCP基因序列(E值小于1×10-10)。將下載的結果與PlantTFDB數據庫(http://planttfdb.cbi.pku.edu.cn/)中下載的序列進行比對，去除冗余，得到候選基因。利用InterPro(http://www.ebi.ac.uk/interpro/)在線驗證候選基因，鑒定其編碼蛋白質是否含有TCP結構域。使用ExPASy(http//www.expasy.org/)對最終所篩選出的氨基酸序列進行在線分析，以確定蛋白質的氨基酸長度、分子質量、等電點、疏水性平均值。

1.2.2 高粱TCP基因的染色體定位 利用Mapinspect工具對高粱TCP基因進行染色體定位。

1.2.3 高粱TCP蛋白保守結構域、保守基序(Motif)分析及系統進化樹構建 將TCP基因家族成員保守結構域序列在ClustalX軟件上進行比對，在GeneDoc軟件中進行灰度標注。利用在線網站MEME(http://meme-suite.org/tools/meme)對高粱TCP基因家族成員進行Motif分析，參數中預測數目設置為10，其余均為默認設置。將所有的高粱TCP蛋白和PlantTFDB網站下載的擬南芥TCP蛋白在MEGA 6.0軟件中通過最大簡約法構建進化樹。

1.2.4 高粱TCP基因表達模式分析 通過qTeller數據庫(http://qteller.com/)得到高粱TCP基因在不同組織中的表達量，整合數據后通過MEV 4軟件制圖。

2 結果與分析

2.1 高粱TCP基因家族成員的鑒定及染色體分布

經篩選鑒定，共獲得27個高粱TCP基因(表1)。高粱TCP基因編碼的氨基酸數目差異較大，最多可以編碼627個氨基酸(SbTCP10),最少編碼80個氨基酸(SbTCP5),平均編碼325個氨基酸。高粱27個TCP蛋白的分子質量在8 194.28～65 896.42 ku，等電點平均值為7.9，其中有17個大于7.0，呈堿性，有10個小于7.0，呈酸性。

27個高粱TCP基因在染色體上的位置見圖1。

表1 高粱TCP基因家族成員基本信息

圖1 高粱TCP基因染色體定位Fig.1 Chromosome localization analysis of TCP genes in sorghum

27個高粱基因在10條染色體上不均勻分布，5號染色體上沒有分布。其中，1、4、6號染色體上各有3個基因，2、9號染色體上各有4個基因，3號染色體上有6個基因，7號染色體上有2個基因，8、10號染色體上各有2個基因。在1號染色體上SbTCP1和SbTCP2聚為一簇，3號染色體上的SbTCP8、SbTCP9和SbTCP10聚為一簇， 6號染色體上的SbTCP17和SbTCP18聚為一簇，9號染色體上的SbTCP23—SbTCP26基因聚為一簇。

2.2 高粱TCP蛋白的分類及系統進化分析

將27個高粱TCP蛋白與24個擬南芥TCP蛋白構建進化樹(圖2)。結果表明，27個高粱TCP蛋白可分為2類：ClassⅠ和ClassⅡ。ClassⅠ(PCF)包含10個高粱TCP蛋白、13個擬南芥TCP蛋白；ClassⅡ中的CYC/TB1包含3個高粱TCP蛋白、3個擬南芥TCP蛋白， CIN包含14個高粱TCP蛋白、8個擬南芥TCP蛋白。

圖2 高粱和擬南芥TCP蛋白的系統進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of TCP proteins in sorghum and Arabidopsis

2.3 高粱TCP蛋白保守結構域分析

對高粱TCP蛋白的保守結構域進行比對(圖3)發現，27個高粱TCP蛋白均包含有TCP結構域，即bHLH結構域,且在Basic區保守程度較高。ClassⅠ類成員在Basic區缺少第12、13、14、16位的4個氨基酸，ClassⅡ類的CIN亞組的SbTCP5蛋白缺少雙螺旋區的氨基酸。在這27個TCP蛋白中發現2個存在R結構域，分別為SbTCP3、SbTCP4(圖4)。

2.4 高粱TCP蛋白的Motif分析

通過MEME在線分析高粱TCP蛋白的Motif,將鑒定的10個Motif命名為Motif1—Motif10(圖5)。結合高粱系統進化樹進行分析發現，ClassⅠ類成員都只含有Motif1和Motif9(除SbTCP13還含有1個Motif10外)；ClassⅡ類中除SbTCP5蛋白只含有1個Motif5外，其他成員都有1個Motif1和1個Motif5,且ClassⅡ類的CYC/TB1亞類中SbTCP3、SbTCP6、SbTCP20蛋白都僅含1個Motif1和1個Motif5,而ClassⅡ類的CIN亞類中SbTCP22蛋白也僅有1個Motif1和1個Motif5,其余TCP蛋白還含有其他Motif。

2.5 高粱TCP基因的表達模式和功能分析

由圖6可知，高粱TCP基因在高粱各組織中的表達量不同。大部分高粱TCP基因在根、嫩枝、胚乳、胚、種子、葉片、花序原基、早期花序、雌蕊、花藥、花粉中均有所表達。但ClassⅡ中的CYC/TB1亞類基因(SbTCP3/6/20)在這些組織中都不表達或表達量很低。SbTCP25/26/24/23在胚、早期花序、葉片中表達量較高；SbTCP1/2在胚、早期花序、雌蕊、種子、花序原基中表達量較高；SbTCP8/9/10在胚、雌蕊、早期花序、種子中表達量較高；SbTCP17/18在胚、嫩枝、早期花序、雌蕊、種子中表達量較高。其他TCP基因在高粱各組織中的表達量各不相同，其中在雌蕊、胚、早期花序中表達量較高，在胚乳、花粉和花藥中表達量很低。總體來看，ClassⅠ大部分成員在種子、胚、雌蕊、早期花序中表達量較高，ClassⅡ中的CIN亞類在種子、葉片、胚、雌蕊、早期花序中的表達量也較高。

圖3 高粱TCP蛋白保守結構域序列比對分析Fig.3 Alignment of conserved sequence of TCP proteins in sorghum

圖4 高粱TCP蛋白R結構域序列分析Fig.4 Alignment of the R-domain sequence of TCP proteins in sorghum

圖5 高粱TCP蛋白家族成員Motif分析Fig.5 Conserved motifs analysis of TCP proteins in sorghum

圖6 高粱TCP基因表達模式分析Fig.6 Expression pattern analysis of TCP genes in sorghum

從qTeller網站下載高粱根和嫩枝TCP基因在ABA(脫落酸)、NaOH、PEG(聚乙二醇)和H2O處理下的表達量,其中ABA處理與NaOH處理進行對比分析，PEG處理與水處理進行對比分析。由圖6可知，與 NaOH處理相比，ABA處理后根中大部分TCP基因表達量降低，如SbTCP25/26/24/23/1/2/4/8/9/10/17/18/14/19/16/15/27等；在嫩枝中有5個TCP基因表達量明顯降低，包括SbTCP25/26/24/23/12，2個TCP基因(SbTCP19/15)表達量明顯升高。與水處理相比，PEG處理根中大部分TCP基因表達量明顯升高，如SbTCP25/26/24/23/12/11/14/15/27等；在高粱嫩枝中，大部分TCP基因表達量下降，如SbTCP25/26/24/23/12/10等，但有個別基因表達量升高，如SbTCP4/15等。

3 結論與討論

TCP是植物特異轉錄因子家族，不同物種中TCP家族基因數量不同，如大豆中有54個TCP基因[20]，辣椒中有30個[21]，毛竹中有19個[22]，擬南芥中有24個[23]。高粱TCP成員與這些植物的TCP家族成員有著共同的特征，都含有保守的TCP結構域，且只有2個成員含有R結構域，而番茄中有6個成員具有R結構域[24]，擬南芥中有5個成員具有R結構域[23]。

已有研究證實，大部分TCP轉錄因子在植物生長發育的過程中起重要作用，例如配子體發育、激素信號轉導[17]、線粒體生物合成、植物生物節律調節、側枝發育[13]、花發育[9]、種子萌發[8]以及葉片發育[9]等。高粱的大部分TCP基因在種子、胚、雌蕊、早期花序中表達量較高，在胚乳、花粉和花藥中表達量較低，僅ClassⅠ(PCF)類成員的SbTCP21在花藥中表達量較高， ClassⅠ大部分成員在種子、胚、雌蕊、早期花序中表達量較高。研究表明，擬南芥的ClassⅠ類基因AtTCP11/14/16在種子萌發和配子體發育過程中起重要的調控作用[26]，暗示高粱ClassⅠ成員可能也有類似作用。而ClassⅡ中的CYC/TB1亞類基因(SbTCP3/6/20)在各組織中不表達或表達量很低，CIN亞類的SbTCP5基因也不表達或表達量很低。CIN亞類大部分成員在葉片、雌蕊、胚、種子、早期花序中表達量較高，擬南芥CIN亞類的AtTCP2/3/4/5/10/13/17/24基因參與擬南芥葉片、花發育過程[8]，暗示高粱CIN成員可能也有類似作用。

TCP家族是一類與系統發育相關的植物特異轉錄因子，它可以在激素信號的上下游發揮作用或與激素信號互作來促進/抑制激素合成，調控相關基因表達，最終對植物的生長發育起調控作用[26]。在大豆中研究發現，GmCYL(CYC/TB1-like)基因屬于TCP轉錄因子家族ClassⅡ類的CYC/TB1亞類成員，在葉和根中，分別不同程度地受ABA、油菜素內酯(BR)、氨基-環丙烷羧酸(ACC)、水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)等誘導表達[27]。擬南芥AtTCP18基因受外源生長素的調控，從而參與植物分枝的形成過程[23]。ABA是一種重要的外界脅迫信號激素，參與維持和促進種子和芽的休眠[26]。在小麥的所有TCP基因中TaTCP5基因的表達量在熱和干旱脅迫下明顯上調[28]。本研究發現，ABA誘導下，根和嫩枝中的大部分基因的表達量下降；PEG處理下，根中大部分基因的表達量升高，嫩枝中大部分基因的表達量下降。在ABA和PEG脅迫下，上調表達的TCP基因可能在植物干旱脅迫響應中起重要作用。但是這些基因具體的功能和作用機制還要通過試驗進一步驗證。