北疆地區豬圓環病毒3型PCR檢測及分析

魏 其，董 斌，屈勇剛，谷思穎，吳圓圓，于會舉

（石河子大學動物科技學院，新疆 石河子 832000）

2015年，美國堪薩斯州立大學獸醫學診斷實驗室Palinski等[1]從患有皮炎腎病綜合征與繁殖障礙的豬中，通過宏基因組測序及遺傳進化分析檢出了一種新型豬圓環病毒（Porcine circovirus），將其命名為豬圓環病毒3型（Porcine circovirus type 3,PCV3）[2]。

PCV3呈二十面體結構，無囊膜，基因組為單股的DNA，它的全長為2 000 bp。包括3個主要開放閱讀框（ORF）[3]，其中 ORF1 編碼復制酶蛋白 rep，由297個氨基酸組成；ORF2編碼由214個氨基酸組成衣殼蛋白Cap，兩者復制方向相反；目前關于ORF3的研究仍不健全，在Rep和Cap基因間隔區5'端存在莖-環結構[3-4]，Cap蛋白是PCV重要的構成蛋白，可引發機體產生特異性免疫應答。

PCV3作為一個新發現的病毒，流行的范圍較廣。2016年以來前后有美國、中國、韓國、巴西、波蘭等國報道發現此病毒。截至目前，我國已有28個省市豬場存在PCV3感染。北疆地區PCV3的感染及其流行程度、危害程度目前尚不清楚，急需開展相應工作。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 樣品來源 試驗于2019年4—8月在石河子大學進行。樣品取自北疆某具有代表性的規模化養豬場，并采取 0~6、7~13、14~20、21~27、28~39、40~59、60日齡豬以及母豬血樣各5份，共40份血液樣品，于-80℃溫度下保存。

1.1.2 主要試劑及試驗儀器 試驗主要試劑：pEASY-T1 Simpie Cloning Kit、2K DNA Marker、2×EasyTap PCR SuperMix（購自全式金生物技術有限公司），TIANGENG Genomic DNA Kit（購自天根生化科技有限公司），FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit（購自南京諾唯贊生物科技有限公司），氯化鈉，酵母粉，胰蛋白胨，瓊脂粉，氨芐青霉素，50%甘油。

試驗所需儀器：凈化工作臺、HH-s3數顯恒溫水浴鍋、高速臺式離心機、梯度PCR儀、電子天平、冰箱、微波爐、制冰機、高壓蒸汽滅菌鍋、核酸電泳儀、凝膠成像系統。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA的提取 按照TIANGENG Genomic DNA Kit提取試劑盒說明書提取DNA。

1.2.2 巢式PCR擴增 按照參考文獻[4]合成PCV3分離株的部分衣殼基因序列PCV-F1R1和PCV3F2R2，引物由北京華大基因科技有限公司合成，引物序列如表1。利用巢式PCR方法進行基因檢測，PCR 的反應體系：Mix 15 μL，ddH2O 11 μL，上、下游引物各1.5 μL，DNA模板1 μL。擴增條件：95℃預變性5 min；95℃變性30 s，60℃退火 30 s，72℃延伸45 s，35個循環；72℃終延伸10 min。

表1 PCV3引物序列

1.2.3 擴增產物回收純化 取PCR產物7 μL，利用凝膠電泳試驗，通過凝膠成像儀觀察電泳結果。

PCR產物與目的條帶大小一致為陽性條帶，并將相應大小條帶的膠切下，使用FastPure Gel DNA Extraction Mini Kit進行凝膠回收純化。

1.2.4 DNA連接轉化 連接至pEASY-T1載體上，轉入感受態細胞Transl-T1，通過Amp/LB抗性進行篩選。

1.2.5 菌液PCR驗證 在含有氨芐青霉素的LB平板上培養8~10 h，在平板上不同區域挑取10個單個菌落，將其分別接種于1 mL的含有氨芐青霉素的LB液體培養基的離心管中，并做好標記，置于37℃、180 r/min的震蕩培養箱中培養6 h，使用pEASY-T1 Simple Cloning Kit進行菌液的PCR驗證。陽性克隆菌落經PCR進一步鑒定后，保存于50%的滅菌甘油中。1.2.6 序列測定與分析 將驗證后的陽性克隆送北京華大基因生物技術公司測序，將測序結果運用MEGA 6.06軟件進行比對和分析。

2 結果

2.1 巢式PCR檢測結果

PCR檢測得到的目的片段擴增的片段大小約為329 bp。在檢測的40份樣品中，有20份樣品PCR檢測陽性，平均陽性率為50%（20/40）。在該豬場0~6日齡豬陽性率達60%（3/5）；7~13日齡豬陽性率達80%（4/5）；14~20日齡豬陽性率達 80%（4/5）；21~27日齡豬陽性率達40%（2/5）；28~39日齡豬陽性率達 40%（2/5）；40~59日齡豬陽性率達 20%（1/5）；60日齡豬陽性率達20%（1/5）；母豬陽性率達60%（3/5）。陽性樣品呈明亮條帶，如圖1。

圖1 PCV3基因片段的PCR擴增產物瓊脂糖凝膠電泳結果

2.2 菌液PCR鑒定結果

菌液PCR結果與目的基因大小一致（329 bp），如圖2。

2.3 PCV3序列的測定與分析

經測序后大小與目的大小一致，將其中2株PCV3基因序列，運用MEGA 6.06軟件與國內外13株PCV3參考序列進行遺傳進化情況分析，建立的遺傳進化樹如圖3。結果表明本試驗所獲得的2株基因序列與中國河北株MH101645.1 PCV3CHHBHD2017、中國湖南株MG745690.1PCV3-CN-Hunan-1、中國江西株KY354057.1PCV3-CN-Jiangxi-28-2016、韓國株 KY 996345.1 PCV3KU-1609、墨西哥株 MH192340.1 PCV3 MEXGTO012017、中國新疆株MH216037.1 PCV3-CN-Xinjiang-3-2017、中國江蘇株MF769806.1 PCV3-CN-Jiangsu-170266-25、中國天津株MH579786.1 PCV3-CH-Tianjin-2-2017在同一分支，屬于3a亞群。

圖3 PCV3核苷酸序列的遺傳進化樹

運用MEGA 6.06軟件將本試驗所獲得的2株PCV3基因序列與國內外的13株PCV3參考序列進行了同源性比較，結果發現本試驗所獲得的2株PCV3毒株之間的相似性很高，達99.40%。與國外參考毒株相比，同源性為97.90%~99.70%，具體見圖4。

圖4 北疆地區豬場與國內外PCV3基因序列同源性分析

3 討論與分析

2015年首次報道PCV3的發現后，許多國家均陸續檢測到PCV3的DNA，在中國已有28個省市的商業養豬場中發現PCV3[5-11]。在斷奶仔豬、保育豬和母豬中都檢測到了PCV3，這些結果證明了在豬生長的不同時期都有可能感染該病毒，這種感染動態與PCV2形成對比，后者主要感染5~12周齡的豬，而在哺乳期則很少感染豬[11-12]。這可以通過以下事實來解釋：初乳中的抗體對哺乳仔豬具有保護作用，然后在哺乳期和斷奶期抗體隨之下降。一旦母體產生的抗體減弱，就會發生活躍的血清轉化，而后容易被感染[12-14]，這種血清變化通常發生在9~15周齡之間，抗體至少可能持續至28周齡[13-16]。但是目前完全缺乏關于PCV3的母豬感染、母體免疫力以及免疫力如何保護的信息。眾所周知，PCV3可以在初乳中被發現[17-19]，這代表著有垂直傳播（母豬播種）的可能性并強調早期感染的潛在重要性。同樣，本試驗中在0日齡的仔豬體內檢測到陽性率為60.0%（3/5），母豬陽性率為60.0%（3/5），這可能是存在母體本身已感染PCV3，通過胎盤直接傳播，引起仔豬一出生就帶有該病毒。7~13日齡豬、14~20日齡豬PCV3陽性率為80.0%，21~27日齡、28~39日齡為40.0%，40~60日齡為20%，日齡越大陽性率越低，初步可以推測日齡大的豬經過免疫力的提高對該病毒抵抗力越好，感染該病毒的概率越低，本試驗結果與上述研究結果一致，但是目前該研究還較少，還需進一步深入研究證實。

遺傳進化分析表明，本試驗得到的2株序列與中國河北株MH101645.1 PCV3CHHBHD2017、中國湖南株MG745690.1 PCV3-CN-Hunan-1、中國江西株KY354057.1PCV3-CN-Jiangxi-28-2016、韓國株KY996345.1PCV3KU-1609、墨西哥株MH192340.1 PCV3MEXGTO012017、中國新疆株 MH216037.1 PCV3-CN-Xinjiang-3-2017、中國江蘇株MF769806.1 PCV3-CN-Jiangsu-170266-25、中國天津株MH579786.1 PCV3-CH-Tianjin-2-2017在同一分支，同屬3a亞群。結果發現PCV3毒株之間相似性很高。

目前關于PCV3的了解很少，并已被確定為與豬病相關的病原體。然而，新疆地區PCV3的流行狀況和遺傳特征尚不清楚。本試驗在新疆地區檢測出該病毒，我們推測PCV3是一種可以根據上述結果垂直傳播的潛在病原體。以上結果對于更好地了解中國的PCV3至關重要，但是需要進一步研究以分離PCV3，探索其生物學和致病性特征。