從江香豬MC4R基因SNP位點遺傳性狀及關(guān)聯(lián)性分析

李 俊，毛世明，陳大芳，龍清孟，李 平，周 迪，張 勇，張 雄，馮文武，譚曉山，李 波，申金容

（1.貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心，貴州 貴陽 550021；2.貴州大學動物科學學院貴州 貴陽 550025；3.貴州省畜牧獸醫(yī)研究所貴州 貴陽 550005）

黑素皮質(zhì)激素受體-4（Meloaocrtin Recepto-4,MC4R）是丘腦腹內(nèi)側(cè)核（Ventromadial hypothalam,VMH）分泌的一種肽類物質(zhì)，它是G蛋白偶聯(lián)受體超家族的一個成員[1]。在哺乳動物中，黑皮質(zhì)素4受體（MC4R）信號系統(tǒng)主要與食欲和能量穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)有關(guān)[2]。在人類和鼠的體重、能量穩(wěn)態(tài)和采食量的調(diào)控中具有重要作用，是第一個發(fā)現(xiàn)的與人類顯性遺傳性肥胖相關(guān)的靶位點。Vaisse等[3]報道了MC4R的2個SNPs與人早期遺傳性肥胖存在密切關(guān)聯(lián)；Valli-Jaakola等[4]發(fā)現(xiàn)，MC4R基因啟動子區(qū)439 bp的缺失突變與人早期遺傳性肥胖有關(guān)。Huszar等[5]利用基因敲除的方法生產(chǎn)的MC4R基因缺失（MC4R-/-）小鼠出現(xiàn)遺傳性肥胖，表現(xiàn)出采食量增加、脂肪沉積和過量分泌胰島素等，首次證明了MC4R對能量代謝平衡有調(diào)控作用。據(jù)Kim等[6]研究發(fā)現(xiàn)，豬的MC4R基因定位于1號染色體的lq22-q27之間，編碼332個氨基酸，第7跨膜結(jié)構(gòu)功能域一個高度保守區(qū)的Asp298Asn錯義突變與豬的背膘厚、生長速度及采食量呈強相關(guān)。肖石軍等[7]、楊曉慧等[8]、李星潤等[9]發(fā)現(xiàn)MC4R基因Asp298Asn位點與商品雜交豬的生長速度、背膘厚度顯著相關(guān)。趙聰哲等[10]在大白豬的MC4R基因序列中檢測到1個突變位點2207A＞G，2個等位基因A和G，3個基因型AA、AG和GG，關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)MC4R基因?qū)Υ蟀棕i體重及日增重具有顯著影響。綜上研究表明，MC4R基因的多態(tài)性與豬的生長速率、采食量、背膘厚和肉質(zhì)性狀均具有相關(guān)性。

本試驗以從江香豬為研究對象，在張雄等[11]的研究基礎上，對在從江香豬上發(fā)現(xiàn)的MC4R基因SNP位點繼續(xù)進行多態(tài)性及連鎖不平衡分析，利用基因型信息重構(gòu)單倍型，尋找與從江香豬胴體性狀相關(guān)或緊密連鎖的遺傳標記，從分子水平探索該基因?qū)慕阖i胴體性狀的影響，從而與傳統(tǒng)育種技術(shù)與科學的飼養(yǎng)管理技術(shù)相結(jié)合，提高從江香豬胴體性狀。

1 試驗與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試驗時間與地點 試驗于2018年3月至2019年6月在貴州省貴陽市烏當區(qū)羊昌鎮(zhèn)綠生源香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場和貴州省種畜禽種質(zhì)測定中心實驗室進行。

1.1.2 試驗動物 試驗樣品為74頭從江香豬耳組織，采自貴陽市烏當區(qū)綠生源香豬生態(tài)福利養(yǎng)殖場。用耳號鉗取耳組織1.5 g，標記后分別放入裝有1 mL 70%乙醇的2 mL離心管中，帶回實驗室-20℃保存，用于DNA提取。

1.1.3 主要試劑及儀器 組織基因組DNA提取試劑盒、2×Taq Master Mix、核酸染料、瓊脂糖、DL 2 000 DNA Marker等試劑均購自上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司；去離子水、無水乙醇、TAE緩沖液等試劑實驗室自備。PCR擴增儀（C1000 Touch），凝膠成相系統(tǒng)（G：BOX F3），紫外分光光度計（NanoDrop-ONE），去離子純水儀（Milli-Q Intergral 3），電泳儀（JY-600E），微量移液器（eppendorf）等。

1.2 試驗方法

1.2.1 DNA提取 用基因組DNA提取試劑盒提取DNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，凝膠成像系統(tǒng)照相保存，并用紫外分光光度計測量每個DNA樣品濃度3次，取其平均值，用ddH2O將所有DNA樣品調(diào)至100 ng/μL，-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計與PCR擴增 參照GenBank（登錄號為NC_010443.4）提供的豬MC4R基因序列，以及張雄等[11]通過構(gòu)建DNA池發(fā)現(xiàn)的從江香豬MC4R基因3個SNP位點，運用NCBI中的Primer-BLAST設計引物，委托賽默飛世爾科技（中國）有限公司合成，引物序列及擴增條件見表1。

表1 MC4R基因引物序列、退火溫度、擴增長度及區(qū)域

1.2.3 PCR反應體系及條件 采用25 μL PCR反應體系，即 DNA 模板 2.5 μL，2×Taq Master Mix 12.5 μL，上、下游引物各 1.5 μL，ddH2O 7 μL。PCR 反應條件為：95℃預變性4 min；94℃變性30 s，退火30 s（退火溫度見表1），72℃延伸1 min，共34個循環(huán)；72℃再延伸10 min；最后得到的PCR產(chǎn)物4℃保存，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物，凝膠成像系統(tǒng)照相保存，將擴增好的74個樣品送英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司測序。

1.2.4 統(tǒng)計分析 將測序得到的DNA序列用DNAStar等軟件進行序列對比，篩選SNP位點，計算不同位點在受試群體中的基因型頻率、等位基因頻率、有效等位基因數(shù)（Ne）、群體遺傳純合度（Ho）、雜合度（He）和多態(tài)信息含量（PIC），并進行哈迪-溫伯格平衡檢測；根據(jù)最小二乘線性模型，分析不同基因型與樣本胴體性狀的關(guān)聯(lián)效應。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCR產(chǎn)物檢測

PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，均顯示為一條特異性條帶，其片段長度P1、P2分別為162 bp、183 bp，與目的片段相符，條帶清晰、整齊無拖尾，可用于測序（圖1）。

圖1 PCR產(chǎn)物電泳檢測結(jié)果

2.2 測序結(jié)果分析

運用SeqMan軟件對所有樣品的測序結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)（圖2），在第2外顯子1 577 bp處發(fā)生堿基突變，即C/A突變，分別定義為GG、GA、AA基因型，該突變?yōu)殄e義突變，導致所編碼氨基酸第298位天冬氨酸變?yōu)樘於０穂11]。G1699A位點分型為EE、EF、FF基因型，T1702A位點分型為MM、MN、NN基因型。通過序列對比發(fā)現(xiàn)，GG基因型、EE基因型、MM基因型個體的序列與GenBank上提交的序列相一致，定義為野生型，AA基因型、FF基因型、NN基因型定義為突變型，GA基因型、EF基因型、MN基因型為雜合型。

圖2 MC4R基因3個SNP位點測序結(jié)果

2.3 SNP位點的基因型頻率及遺傳特異性分析

從群體遺傳學角度分析從江香豬MC4R基因SNP位點的基因型和等位基因頻率（表2）。從表2可看出，對于G1577A位點，GG基因型頻率最高，表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型；G、A等位基因頻率分別為70.9%、29.1%，且G為優(yōu)勢等位基因。在G1699A位點和T1702A上，EF、MN基因型頻率均為47.3%，為優(yōu)勢基因型；E和M等位基因頻率最高均為68.2%，表現(xiàn)為優(yōu)勢等位基因。

通過對G1577A、G1699A、T1702A位點的遺傳結(jié)構(gòu)進行分析，均發(fā)現(xiàn)這3個SNP位點在試驗群體中純合度（Ho）較高，雜合度（He）則相對較低，表明這3個SNP位點在群體中的變異較小；G1577A、G1699A、T1702A位點有效等位基因數(shù)（Ne）分別為1.7、1.8、1.8，接近于實際檢測到的2個等位基因數(shù)；而3個位點的多態(tài)信息含量（PIC）分別為0.33、0.34、0.34，均表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25＜PIC＜0.50），經(jīng) χ2適合性檢驗結(jié)果表明，G1577A、G1699A、T1702A位點均未偏離Hardy-weinberg平衡（P＞0.05）。

表2 從江香豬MC4R基因3個SNP位點基因型頻率、等位基因頻率及遺傳特異性分析（n=74）

2.4 連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建

利用SHEsis在線軟件對MC4R基因3個多態(tài)位點進行連鎖不平衡參數(shù)估計及單倍型構(gòu)建，見表3和表4，結(jié)果表明，3個多態(tài)位點間分別處于連鎖不平衡狀態(tài)，且G1699A位點與T1702A位點處于連鎖完全不平衡。3個位點可構(gòu)建4種單倍型，即：A-EM，A-F-N，G-E-M，G-F-N，分別命名為 H1，H2，H3，H4；其中H1、H3和H4為主要單倍型，頻率分別為25.7%、42.3%、29.0%，H2單倍型頻率最低，為3%。

表3 3個SNP位點之間的連鎖不平衡參數(shù)估計

表4 3個SNP位點的單倍型構(gòu)建及頻率

2.5 MC4R基因不同基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析

從江香豬MC4R基因G1577A位點、G1699A位點、T1702A位點不同基因型與肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚的最小二乘分析結(jié)果見表5。由表5可知，在G1577A位點上，GA基因型的肌內(nèi)脂肪、背膘厚、皮厚指標依次高于GG基因型、AA基因型，差異不顯著（P＞0.05）；而眼肌面積為GG基因型＞GA基因型＞AA 基因型，差異不顯著（P＞0.05）。對于 G1699A位點和T1702A位點，2個位點的3種基因型個體的肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚的平均值完全一樣，不同基因型之間差異均不顯著（P＞0.05），肌內(nèi)脂肪為：EF基因型＞EE基因型＞FF基因型，MN基因型＞MM基因型＞NN基因型；眼肌面積、背膘厚、皮厚為：EE基因型＞EF基因型＞FF基因型，MM基因型＞MN基因型＞NN基因型。

表5 不同基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析

通過SPSS 18.0軟件分肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚之間的相關(guān)性（表6），結(jié)果發(fā)現(xiàn)從江香豬的不同胴體性狀指標之間的相關(guān)系數(shù)r＞0，均成正相關(guān)；且肌內(nèi)脂肪與背膘厚、背膘厚與皮厚、背膘厚與眼肌面積之間的相關(guān)系數(shù)r分別為0.405、0.396、0.366，且都表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

表6 不同胴體性狀指標之間的相關(guān)性分析

3 討論

本研究通過直接送出74頭從江香豬的MC4R基因PCR產(chǎn)物測序發(fā)現(xiàn)G1577A、G1699A、T1702A位點，與張雄等[11]利用DNA池篩選到的G1577A、G1699A、T1702A位點相一致。通過對3個SNP位點進行多態(tài)性分析以及與從江香豬的胴體性狀關(guān)聯(lián)性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)3個位點分別產(chǎn)生3種不同的基因型，其中GG基因型、EF基因型、MN基因型表現(xiàn)為優(yōu)勢基因型，且G、E和M表現(xiàn)為優(yōu)勢等位基因。而韓雪蕾等[12]也發(fā)現(xiàn)MC4R基因的D298N變異位點在4個豬群中均存在多態(tài)性，其中G等位基因為優(yōu)勢等位基因。遺傳結(jié)構(gòu)分析顯示3個位點的有效等位基因數(shù)接近于2，且多態(tài)信息含量表現(xiàn)為中度多態(tài)，表明3個多態(tài)位點在該群體中分布均勻，且能比較合理地提供遺傳信息。但G1699A位點、T1702A位點的基因型頻率和基因頻率，以及純合度、有效等位基因數(shù)、多態(tài)信息含量等指標均表現(xiàn)完全一致，猜測由于兩位點相隔太近，中間只相差2個堿基，導致兩位點處于連鎖不平衡狀態(tài)。因此，通過連鎖不平衡分析與單倍型構(gòu)建發(fā)現(xiàn)，3個位點相互之間處于連鎖不平衡狀態(tài)，且G1699A位點與T1702A位點處于連鎖完全不平衡。

目前，用單倍型來研究數(shù)量性狀基因座（QTL）與動物的各生產(chǎn)性能之間的相關(guān)性，是將來研究候選基因的一個發(fā)展趨勢，其與單個SNP位點分析相比，能提高相關(guān)分析的準確性，是更可靠更有效的分子標記[13]。構(gòu)建單倍型需要進行連鎖不平衡分析，若兩個SNPs位點不處于連鎖不平衡狀態(tài)，說明兩個SNPs位點之間是相互獨立的，互不影響，那么構(gòu)建單倍型也就無意義。連鎖不平衡常用r2和D'度量，r2值的大小與關(guān)聯(lián)分析的效力相關(guān)[14]。研究表明[15-16]，從0～1度量越高，LD越高，如果兩個位點連鎖，連鎖程度也越強；當D'=0，r2=0時處于完全連鎖平衡狀態(tài)，D'=1，r2=1時處于完全連鎖不平衡狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，上述3個SNP位點兩兩之間均處于連鎖不平衡狀態(tài)，可構(gòu)建4種單倍型，其中H1、H3和H4為主要單倍型。由于該研究的試驗樣本較少，有些單倍型所占比例太小，對試驗結(jié)果造成一定的誤差，未進行單倍型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析，因此，還需進一步擴大試驗樣本加以驗證。

通過MC4R基因不同基因型與胴體性狀的關(guān)聯(lián)性分析發(fā)現(xiàn)，G1577A位點、G1699A位點、T1702A位點不同基因型以及不同基因型組合與肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚之間差異均不顯著（P＞0.05），但GA、EF基因型的肌內(nèi)脂肪高于其他基因型，GG、EE、MM基因型的眼肌面積高于其他基因型，AA、FF、NN基因型的背膘厚和皮厚低于其他基因型。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)，不同胴體性狀指標之間的相關(guān)系數(shù)r＞0，均成正相關(guān)；且肌內(nèi)脂肪與背膘厚、背膘厚與皮厚、背膘厚與眼肌面積之間的相關(guān)系數(shù)r分別為0.405、0.396、0.366，且都表現(xiàn)為極顯著正相關(guān)（P＜0.01）。

4 結(jié)論

本試驗發(fā)現(xiàn)從江香豬MC4R基因3個SNP位點，且處于連鎖不平衡狀態(tài)，可構(gòu)建4種單倍型；關(guān)聯(lián)分析初步推斷，MC4R基因 G1577A、G1699A、T1702A位點可能是影響從江香豬胴體性能的3個分子標記，GA、EF、MN基因型可能為影響從江香豬肌內(nèi)脂肪的有利基因型，GG、EE、MM基因型影響從江香豬眼肌面積的有利基因型，AA、FF、NN基因型為影響從江香豬背膘厚和皮厚有利基因型。但由于本試驗樣本數(shù)少、品種單一，具有一定局限性。因此，在今后的研究中，將擴大樣本數(shù)，并在肌內(nèi)脂肪、眼肌面積、背膘厚、皮厚差異較大品種中驗證這3個SNP位點是否對從江香豬胴體性能產(chǎn)生影響，為今后推動從江香豬高產(chǎn)肉性能品系的選育提供參考。