Alda-1通過激活線粒體乙醛脫氫酶2改善大鼠肺缺血再灌注損傷

張裕堅，林婷婷，夏芳芳，董嬌嬌，金周晟，劉樂

（溫州醫科大學附屬第一醫院 麻醉科，浙江 溫州 325015）

肺缺血再灌注損傷（lung ischemia-reperfusion injury，LIRI）廣泛存在于各種臨床事件中，如肺栓塞、肺移植、體外循環術等，期間形成活性氧自由基、炎癥級聯反應、鈣超載、細胞凋亡等一系列病生理過程，嚴重影響患者的預后[1]。線粒體乙醛脫氫酶2（aldehyde dehydrogenase 2，ALDH2）是機體內醛類物質代謝的關鍵酶，可將有毒性的醛類物質轉化為無毒性的羧酸類物質起到解毒作用。近年來研究發現激活ALDH2 可減輕心[2-5]、腦[6]、肝[7-8]、腎[9]、腸[10]等臟器的缺血再灌注損傷。本研究在現有基礎上，給予ALDH2 激動劑Alda-1對LIRI進行預處理，檢測肺病理學、醛類物質和ALDH2，從而探求Alda-1減輕LIRI的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料健康成年SPF級雄性SD大鼠，體質量300～350 g，由溫州醫科大學實驗動物中心提供，動物生產許可證號:SCXK（浙）2015-0001。丙二醛（malondialdehyde，MDA）測定試劑盒（硫代巴比妥酸比色法，南京建成生物工程研究所）；大鼠4-羥基壬烯醛（4-hydroxynonenal，4-HNE）ELISA試劑盒（上海研謹生物科技有限公司）；兔抗β-actin多克隆抗體（美國Abcam公司，貨號:ab8227），兔抗ALDH2單克隆抗體（美國Abcam公司，貨號:ab108306），ALDH2 活性比色法檢測試劑盒（美國Biovision公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒（美國Thermo公司）。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及構建大鼠LIRI模型:參考錢小英等[11]的方法復制大鼠在體LIRI模型，采用隨機數字表法將大鼠進行分組，分為假手術組（Sham組）、肺缺血再灌注組（I/R組）和Alda-1預處理組（Alda-1組），每組8只。Sham組開胸后僅顯露左肺門，但不進行結扎；I/R組開胸后阻斷左肺門30 min，再開放恢復供血和通氣120 min；Alda-1組于缺血前1 h腹腔注射Alda-1（6 mg/kg），其余同I/R組。實驗結束取大鼠動脈血用于測MDA及4-HNE；左肺上段置于4%中性甲醛溶液中固定，待作光鏡病理觀察；左肺中段用于肺濕干重比（W/D）測定；左肺下段用于MDA、4-HNE和ALDH2含量及活性的測定。

1.2.2 肺病理學改變:左肺上段固定后做成石蠟包塊，切片，HE染色，并在光鏡下觀察肺泡形態、結構改變及肺間質充血水腫等情況。

1.2.3 W/D測定:取出左肺中段組織，濾紙吸凈表面水分立即稱重并記錄濕重（W），然后置于80 ℃烘箱烘干24 h至恒重，稱干重（D），求得W/D值。

1.2.4 血漿和肺組織的MDA、4-HNE醛類物質含量及肺組織ALDH2的活性:動脈血離心取上層血漿，

左肺下段組織勻漿離心取上清液，根據相應的試劑盒說明書檢測MDA、4-HNE含量及ALDH2活性。

1.2.5 Western blot檢測肺組織ALDH2蛋白相對表達量:左肺下段組織加入含1% PMSF的RIPA強效裂解液，勻漿提取總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度并配置上樣蛋白。用SDS-PAGE分離膠10%，濃縮膠5%電泳，之后采用濕法轉膜將蛋白轉印至0.45 μm的PVDF膜。用含5%脫脂奶粉的TBST室溫下封閉1 h，一抗稀釋液配制ALDH2抗體（1:1 000）和β-actin抗體（1:1 000），將膜放入相應一抗液中4 ℃水平搖床孵育過夜，次日加入1:5 000的山羊抗兔IgG（H+L）HRP室溫孵1 h，后加入ECL發光液，用凝膠成像儀（美國Bio-Rad公司）自動顯影讀取條帶灰度值，以β-actin為內參，計算目的蛋白條帶灰度值與內參條帶灰度值的比值。

1.3 統計學處理方法所有數據應用SPSS22.0軟件進行統計分析。計量資料用±s 表示，3組間比較采用單因素方差分析，方差齊性者采用LSD法，方差不齊者采用Dunnett’s T3檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 肺病理學改變Sham組肺泡結構基本完整，肺間質無明顯充血水腫；I/R組大部分肺泡被破壞，肺泡璧明顯增厚，腔內有大量的紅細胞及水腫液聚集，肺間質明顯水腫伴大量中性粒細胞浸潤；Alda-1組較I/R組，肺泡破壞程度明顯改善，腔內僅有少量紅細胞滲出，肺間質水腫液明顯減少（見圖1）。

2.2 W/D值與Sham組相比，I/R組的W/D值顯著升高，差異有統計學意義（P ＜0.05）；與I/R組比較，Alda-1組的W/D值顯著下降，差異有統計學意義（P＜0.05），見表1。

2.3 血漿和肺組織MDA、4-HNE醛類物質含量的變化

I/R組的血漿和肺組織的MDA、4-HNE含量均高于Sham組（均P＜0.05）；Alda-1組的血漿和肺組織的MDA、4-HNE含量均低于I/R組（均P＜0.05），見表1。2.4 肺組織ALDH2的含量和活性變化 3組肺組織的ALDH2含量差異無統計學意義（P＞0.05）；但在ALDH2活性上，I/R組低于Sham組（P＜0.05），Alda-1組顯著高于Sham組及I/R組（P＜0.05），見表2。

3 討論

肺缺血再灌注過程中產生的活性氧自由基（reactive oxygen species，ROS）奪取細胞膜不飽和脂肪酸側鏈上的氫原子，啟動脂質過氧化鏈式反應，進而生成大量的MDA（短鏈脂肪醛類）、4-HNE（中長鏈脂肪醛類）等毒性醛類物質。這些高活性的脂膜過氧化產物在體內可通過多種途徑產生生物毒性，如作為內源性誘導因子促進細胞凋亡及自噬[12]，修飾含硫蛋白的相關位點，抑制有效蛋白生成或活性改變[13]，作為脂質過氧化的終末產物可誘導巨噬細胞的聚集活化，促進炎癥發生[14]。對于肺組織而言，在保留通氣的條件下發生缺血時，由于持續的氧氣供給，誘導巨噬細胞/內皮細胞/炎癥細胞產生較其他組織器官更多的活性氧自由基，進而形成大量的毒性醛類物質，因此機體對于肺組織內毒性醛類物質的代謝就顯得尤為重要。

圖1 各組肺組織HE染色圖（×200）

表1 各組肺組織W/D及血漿肺組織MDA、4-HNE含量的比較（每組n=8±s）

表1 各組肺組織W/D及血漿肺組織MDA、4-HNE含量的比較（每組n=8±s）

與Sham組比:aP ＜0.05；與I/R組比:bP ＜0.05

?

表2 各組肺組織ALDH2蛋白相對表達量及活性比較（每組n=8，±s）

表2 各組肺組織ALDH2蛋白相對表達量及活性比較（每組n=8，±s）

注:NAD為氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸。與Sham組比:aP＜0.05；與I/R組比:bP ＜0.05

?

ALDH2是已發現的ALDH家族19個成員中對醛類代謝能力最強的同工酶，廣泛參與體內醛類物質的氧化反應。近幾年關于ALDH2與肺部疾病的關系研究也越來越多，CHEN等[15]發現DNA堿基切除修復蛋白XRCC1高表達的肺癌患者總體存活率較差，也許與ALDH2基因低表達，減少醛類代謝有關。AU YEUNG等[16]指出ALDH2突變與肺功能呈負相關，是肺功能不佳、可能發生慢性阻塞性肺疾病的遺傳危險因素。研究表明Alda-1作為一種高選擇性ALDH2小分子激動劑[17]，可以減輕醛類誘導的急性肺損傷和內皮屏障功能障礙[18-19]。

本研究顯示，I/R組的肺組織損傷嚴重，但外源性給予Alda-1 預處理后，可明顯減輕肺組織水腫、改善肺病理學變化，說明Alda-1對LIRI具有保護作用。I/R組的肺組織和血漿中堆積大量的MDA、4-HNE，而Alda-1組則改善了毒性醛類堆積的情況；但3組間的ALDH2蛋白相對表達量沒有變化，只是ALDH2的活性發生了改變，這說明肺缺血再灌注過程并沒有抑制ALDH2的合成，而是通過抑制ALDH2的活性造成醛類堆積，從而造成損傷；而Alda-1主要是通過激活ALDH2的活性，而并不是通過增加ALDH2的合成來發揮加速醛類物質代謝的作用。