百合藥材的DNA條形碼鑒定

姜雪萍，陳艷君，朱富成，王芳，孫傳伯，趙群

（皖西學院生物與制藥工程學院，安徽六安 237012）

中藥百合為百合科（Liliaceae）百合屬（Lilium）植物卷丹（Lilium lancifolium）、百合（L.brownii）或細葉百合（L.pumilum）的干燥肉質鱗葉，為我國傳統的名貴中藥，具有藥、食兩用功能，有“蔬菜人參”的稱號[1-4]。因此，以上3種植物是中藥百合的基源植物。研究表明，百合中含有的多糖等成分具有保健和治療作用[5]。多糖能夠清除羥自由基，阻礙癌細胞繁殖和生長[6-8]。百合具有清心安神和養陰潤肺的功能，主要用于治療陰虛燥咳，勞嗽咳血，失眠多夢和精神恍惚等病癥[9]。由于百合具有藥食兩用價值，僅僅靠野生資源已經難以滿足日益增長的需求[10]。同時，百合在市場上價格較高[11]，一些不法商家用其他廉價的淀粉冒充百合粉。因此，有必要對百合的真偽進行有效鑒別。

目前，主要通過薄層色譜法、顯微觀察結構法等對百合的真偽進行鑒定[4，12-13]。然而，以上方法有的對實驗室的要求較高，操作繁瑣，成本高；有的需要較高的專業知識，因此不能滿足百合真偽快速而有效鑒定的要求。DNA條形碼作為現代分子生物學研究的一種新的分子標記技術，操作起來比較簡便，材料用量少，結果可信度高，能夠對物種進行快速而有效的鑒定[14-16]。該研究以ITS序列為DNA條形碼，研究鑒別中藥百合及其混偽品的DNA條形碼鑒定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

從美國國家生物技術信息中心（NCBI）的GenBank獲取用來構建百合及其混偽品系統發育樹的內群和外群的ITS序列。

以老鴉瓣（Amana edulis）的1條ITS序列為外群，百合正品基源植物和相關混偽品的ITS序列為內群。正品百合的基源植物來源于3個物種，分別為百合科植物卷丹（L.lancifolium）、百合 （L.browniivar.viridulum）和細葉百合（L.pumilum）（表 1）。

表 1 百合藥材及其混偽品ITS序列及GenBank登錄號

1.2 方法

1.2.1 序列分析。用軟件Clustal X 1.81對從GenBank下載的百合、混偽品及外群的ITS部分DNA序列進行比對和排序，再用軟件BioEdit 7.0.9.0[17]進行編輯。用MEGA 4.0軟件[18]統計所有序列的變異位點并按Kimura雙參數法統計所有序列的核苷酸組成，計算種內和種間的遺傳距離。

1.2.2 系統發育樹的構建。以正品和混偽品的ITS部分DNA序列為分子標記，分別用貝葉斯法（Bayesian inference，BI）和簡約法（Maximum parsimony，MP）構建2種系統發育樹。分別用MrBayes 3.1.2軟件[19]和PAUP*4.0 beta 10軟件[20]構建BI樹和MP樹。在構建BI樹時，用MrModeltest 2.3軟件[21]根據AIC（Akaike Information Criterion）檢驗標準選擇最優數據模型（GTR+G）。馬爾科夫鏈的蒙特卡洛方法（MCMC）設置為每條鏈運轉800 000次。MCMC分別運轉2次以便確定其收斂。每100棵樹抽取1個樣本，共形成16 002棵樹的樣本。整個系統運行30 000代后得到的發育樹趨于穩定，用剩余的15 402個樣本建樹并且估計其后驗概率（Posterior probability，PP）值。構建MP樹時，設置自舉重復次數（bootstrap nreps）為1 000次，設置啟發式搜索為由隨機逐步添加法產生起始樹，重復10次，采用TBR分支交換。

2 結果與分析

2.1 序列分析

正品和混偽品的ITS序列經Clustal X 1.81軟件比對后，得到的序列長度為610 bp（包括Gaps），共有266個變異位點，其中包含110個簡約性信息位點（parsimony-informative characters）。所有序列的平均G+C含量為60.1%，百合藥材所有基源植物的平均G+C含量為60.5%，百合ITS序列的G+C含量和所有植物種類幾乎沒有差異。百合藥材的3個正品基源植物百合、細葉百合和卷丹的種內平均遺傳距離分別為0.014、0.106和0.000，而相應各正品基源植物與混偽品之間的平均遺傳距離分別為0.077、0.115和0.057。百合藥材3個正品基源植物種間平均遺傳距離分別小于其與混偽品之間的遺傳距離。

2.2 百合和混偽品之間的系統發育關系

由圖1可知，用BI法和MP法構建的2個系統發育樹主干基本一致。各譜系分支的節點處標有BI樹的后驗概率值和MP樹的自舉支持度（Bootstrap，BS）。在2種系統發育樹中，百合藥材的3個正品基源植物所有ITS序列的單倍型分別以較高的支持度聚類為單獨的譜系分支，其中百合分支的支持度為PP＝1.00 和BS＝99，細葉百合的支持度為PP＝0.99 和BS＝92，卷丹的支持度為PP＝0.99 和BS＝71。而其他混偽品都與以上3種正品百合基源植物的差異明顯，各自聚類于其他的分支，并不和百合藥材的正品基源植物聚類在一起。

圖1 基于ITS序列單倍型貝葉斯分析法重建的百合及其混偽品之間的系統發育樹

3 討論

百合藥材的3個正品基源植物百合、細葉百合和卷丹的種內平均遺傳距離分別小于各自與混偽品之間的平均遺傳距離。所以，DNA的ITS序列可以用作分子標記鑒定百合藥材以及混偽品。由于在ITS序列中，正品百合與其混偽品之間存在特異性堿基位點，可以設計百合的特異性鑒別引物用于百合藥材的快速PCR鑒定。目前，已經有部分中藥材能夠通過特異性PCR來進行快速鑒定[22-27]。

由于百合藥材的3個正品基源植物的單倍型在系統發育樹中各自聚類為單系，所以通過構建系統發育樹，可以將3個正品百合的基源植物分別與混偽品區別開，從而達到鑒別正品百合的目的。在進行鑒別的時候，采用的方法是先測得待測樣品的ITS序列，再將該序列同以上系統樹中的所有正品與混偽品的ITS序列進行比對。檢查待測樣品與已知正品和混偽品之間的遺傳距離并構建BI和MP 2種系統發育樹。若待測樣品和已知正品的遺傳距離小于與混偽品的遺傳距離，并且在系統發育樹中以極高的支持度和正品序列聚類在一起，則可以表示待測的樣品為正品，反之，即為混偽品。