鱉甲水溶性蛋白含量測(cè)定方法比較

翟 玲,夏 雨,楊艷芳,吳和珍,劉焱文,尤朋濤

(湖北中醫(yī)藥大學(xué) 中藥資源與中藥化學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,湖北 武漢430065)

鱉甲為鱉科動(dòng)物鱉(Trionyx sinensisWiegmann)的背甲,具有滋陰潛陽、退熱除蒸、軟堅(jiān)散結(jié)的作用。現(xiàn)代研究顯示,鱉甲可預(yù)防或延緩早期肝纖維化的形成和發(fā)展[1],有抗肝纖維化以及抗腫瘤和免疫調(diào)節(jié)等作用,近年來鱉甲的藥理研究也多集中在這些方面[2-3]。鱉甲富含多種常見的氨基酸[4],經(jīng)煎煮后,起負(fù)抑制效應(yīng)的大分子蛋白變性成為小分子肽類物質(zhì)而發(fā)揮抑制肝星狀細(xì)胞增殖作用[5]。動(dòng)物藥中蛋白、氨基酸的分析檢測(cè)是迅速提升動(dòng)物藥研究水準(zhǔn)和促進(jìn)動(dòng)物藥資源開發(fā)利用的不二捷徑[6],一種準(zhǔn)確且恰當(dāng)?shù)姆治龇椒ㄊ菍?shí)現(xiàn)這一途徑的前提。因此,探究測(cè)定鱉甲水溶性蛋白含量的方法對(duì)鱉甲藥材的質(zhì)量控制具有重要意義。當(dāng)前有關(guān)鱉甲此方面的研究報(bào)道尚不多見。因此,本實(shí)驗(yàn)對(duì)其展開了初步研究。現(xiàn)代提取蛋白主要以有機(jī)溶劑和堿液為溶劑,產(chǎn)量雖高但對(duì)蛋白品質(zhì)影響較大[7-8],而鱉甲的臨床常用劑型為其水煎液。因此,本實(shí)驗(yàn)以水為溶劑。2015版《中國(guó)藥典》共收載了6種測(cè)定蛋白含量的方法,其中Lowry(福林－酚試劑)法是蛋白中酪氨酸和色氨酸與試劑反應(yīng),受蛋白的氨基酸組成影響較大,雙縮脲法本身靈敏度小且樣品用量大,而本實(shí)驗(yàn)需得到準(zhǔn)確高效的測(cè)定方法,但鱉甲水溶液中蛋白的具體組成成分尚不確定。因此,本研究采用其他4種不同的測(cè)定方法進(jìn)行定量分析,以期達(dá)到實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹?/p>

1 材料

1.1 鱉甲飲片

鱉甲經(jīng)湖北中醫(yī)藥大學(xué)吳和珍教授鑒定為鱉科動(dòng)物鱉Trionyx sinensisWiegmann的背甲,經(jīng)質(zhì)量檢測(cè),符合2015版《中國(guó)藥典》的規(guī)定。

1.2 儀器

千分之一電子天平(JA2003)：上海常衡電子科技有限公司；粉碎機(jī)(XL-04B)：廣州市旭朗機(jī)械設(shè)備有限公司；超聲儀(SK7200HP)：上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司；旋蒸機(jī)(RE-2000)：上海亞榮生化儀器廠；酶標(biāo)儀、紫外分光光度計(jì)(SPARK 10M)：瑞士帝肯貿(mào)易有限公司；凱氏定氮儀(K9801)：上海析達(dá)儀器有限公司。

1.3 化學(xué)試劑

氫氧化鈉、硫酸銅、硫酸鉀、硼酸、濃硫酸、溴甲酚綠－甲基紅指示劑、牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；BCA試劑盒、考馬斯亮藍(lán)試劑：南京建成生物工程研究所。

2 方法

2.1 樣品液制備

將鱉甲粉碎,過2號(hào)篩,精密稱取1.00 g鱉甲粉末,加水50 mL,超聲提取兩次,每次30 min,減壓抽濾,合并兩次濾液,經(jīng)濃縮后于50 mL的容量瓶定容置于4℃?zhèn)溆谩５鞍讟?biāo)準(zhǔn)溶液：精密稱取2.00mg牛血清標(biāo)準(zhǔn)蛋白粉末溶于1 mL的水中。

2.2 試劑的配制

BCA工作液：按照BCA Reagent A：BCA Reagent B＝100∶1的比例混合后置于4℃?zhèn)溆谩？捡R斯亮藍(lán)顯色液：按照考馬斯亮藍(lán)儲(chǔ)備液∶雙蒸水＝1∶4的比例進(jìn)行配制。

2.3 定量分析

2.3.1 凱氏定氮法 凱氏定氮法被國(guó)內(nèi)外視為法定的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法[9-10],可作為衡量其他的蛋白定量方法準(zhǔn)確性的標(biāo)準(zhǔn)。其通過測(cè)定樣品中總氮的含量換算出樣品中蛋白含量,測(cè)定步驟依次為樣品的消化、蒸餾、吸收及滴定。樣品的消化：在消化瓶中加入10 mL樣品、0.2 g硫酸銅粉末、6 g硫酸鉀粉末、10 mL濃硫酸和沸石后于通風(fēng)櫥中消化；蒸餾：將10mL消化好的消化液和10mL 30%的氫氧化鈉進(jìn)行水蒸氣蒸餾；吸收：以溴甲酚綠－甲基紅為指示劑用2%的硼酸溶液吸收蒸餾出的氨；滴定：用0.025 mol/L硫酸標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行滴定吸收了氨的硼酸溶液[11]。以2 g/L的蛋白標(biāo)準(zhǔn)蛋白對(duì)凱氏定氮法進(jìn)行校正,測(cè)定表1中3個(gè)不同濃度樣品溶液的蛋白含量,重復(fù)測(cè)定3次。見表2。

表1 凱氏定氮法測(cè)定蛋白含量的溶劑配加

2.3.2 考馬斯亮藍(lán)G-250染色法 考馬斯亮藍(lán)G-250染料與蛋白中的堿性氨基酸和芳香族氨基酸殘基相結(jié)合,顏色發(fā)生改變,且最大光吸收由465nm變成595nm,符合比爾定律(Beer),根據(jù)試劑盒的說明書按表1將各組試液加入96孔板中,用酶標(biāo)儀于595 nm處測(cè)定吸光度,并計(jì)算蛋白含量,實(shí)驗(yàn)獨(dú)立重復(fù)3次。

表2 考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定蛋白含量的溶劑配加

蛋白濃度(g/L)＝(測(cè)定OD值－空白OD值)/(標(biāo)準(zhǔn)OD值－空白OD值)?標(biāo)準(zhǔn)品濃度(0.563 g/L)。

2.3.3 BCA法 BCA法蛋白定量的原理為二價(jià)銅離子(Cu2＋)在堿性條件下被蛋白的肽鍵還原成一價(jià)銅離子(Cu＋),還原后的銅離子濃度與溶液中所含蛋白濃度成正比。Bicinchonininc Acid與一價(jià)銅離子絡(luò)合形成的紫色復(fù)合物在562 nm處有強(qiáng)烈的吸光性。將蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液按表3稀釋,取不同濃度稀釋液各25μL分別加入96孔板中,每孔加入200μL工作液后立即混勻,37℃反應(yīng)30 min后用酶標(biāo)儀于562 nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,重復(fù)測(cè)定3次。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖1。

表3 BCA法測(cè)定蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑配加

圖1 BCA法標(biāo)準(zhǔn)曲線

求得吸光度y與濃度x(mg/mL)的回歸方程y＝0.907 5x＋0.036 66,相關(guān)系數(shù)r＝0.999。結(jié)果表明,蛋白濃度在0～2 mg/mL范圍內(nèi),樣品溶液吸光度與蛋白濃度呈良好線性關(guān)系。按表1配制樣品溶液后于562nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,重復(fù)測(cè)定3次。

2.3.4 紫外吸收法 蛋白分子中,絡(luò)氨酸、苯丙氨酸和色氨酸殘基的苯環(huán)含有共軛雙鍵,使蛋白具有吸收紫外光的性質(zhì)。吸收峰在280 nm處,樣品溶液吸光度與蛋白含量成正比,用紫外分光光度計(jì)測(cè)定得到標(biāo)準(zhǔn)曲線后,通過標(biāo)準(zhǔn)曲線可測(cè)定得到樣品溶液的蛋白濃度。按表4制作標(biāo)準(zhǔn)曲線,重復(fù)測(cè)定3次。所得標(biāo)準(zhǔn)曲線見圖2。

表4 紫外吸收法測(cè)定蛋白含量的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶劑配加

圖2 紫外分光光度測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)曲線

求得吸收度y與濃度x(mg/mL)的回歸方程y＝0.146 5x＋0.012 2,相關(guān)系數(shù)r＝0.991 7。結(jié)果表明,蛋白濃度在0～2mg/mL范圍內(nèi),樣品溶液吸光度與濃度呈良好線性關(guān)系。按表1配制樣品溶液后于280nm波長(zhǎng)處測(cè)定吸光度,重復(fù)測(cè)定3次。

3 結(jié)果

3.1 凱氏定氮法對(duì)樣品的測(cè)定

測(cè)定用時(shí)8～10 h,消耗樣品量較多,操作步驟繁瑣,盡管凱氏定氮法結(jié)果準(zhǔn)確可靠,但目前進(jìn)行蛋白定量并不是首選。將凱氏定氮法所測(cè)得的結(jié)果作為參考值,其他蛋白定量法測(cè)定所得到的結(jié)果與其對(duì)比,在保證測(cè)定結(jié)果準(zhǔn)確的前提下得到高效的測(cè)定鱉甲水溶性蛋白含量的測(cè)定方法。凱氏定氮法測(cè)定3個(gè)不同濃度樣品溶液中蛋白含量的結(jié)果見表5。

表5 凱氏定氮法測(cè)定樣品中蛋白含量結(jié)果

3.2 考馬斯亮藍(lán)G-250染色法對(duì)樣品的測(cè)定

考馬斯亮藍(lán)G-250染色法對(duì)樣品中蛋白含量的檢測(cè)結(jié)果及其測(cè)定結(jié)果與凱氏定氮法的測(cè)定結(jié)果間的偏差見表6。蛋白濃度＜0.5 mg/mL時(shí)偏差≈32%,蛋白濃度在0.5 mg/mL～1mg/mL范圍內(nèi)時(shí)偏差≈31%,蛋白濃度在1 mg/mL～1.5 mg/mL內(nèi)時(shí)偏差≈33%。此法測(cè)定用時(shí)5～10 min。相比凱氏定氮法,考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定用時(shí)短、消耗樣品少、對(duì)操作環(huán)境無特殊要求,兩種方法測(cè)定結(jié)果間的偏差＞30%。

表6 考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定樣品中蛋白含量結(jié)果

3.3 BCA法對(duì)樣品的測(cè)定

樣品按表1分組,通過BCA法測(cè)定,所得數(shù)據(jù)帶入標(biāo)準(zhǔn)回歸方程所得結(jié)果及其測(cè)定結(jié)果與凱氏定氮法的測(cè)定結(jié)果間的偏差見表7。蛋白濃度＜0.5 mg/mL時(shí)偏差≈16%,蛋白濃度在0.5 mg/mL～1 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)偏差≈11%,蛋白濃度在1 mg/mL～1.5 mg/mL范圍內(nèi)時(shí)偏差＜5%。此法測(cè)定用時(shí)40～50 min,相比凱氏定氮法,BCA法測(cè)定用時(shí)短、消耗樣品少、操作簡(jiǎn)單,測(cè)定結(jié)果與凱氏定氮法的測(cè)定結(jié)果間有較小的偏差。

表7 BCA法測(cè)定樣品中蛋白含量結(jié)果

3.4 紫外吸收法對(duì)樣品的測(cè)定

紫外吸收法于280nm波長(zhǎng)處對(duì)樣品中蛋白含量的測(cè)定結(jié)果及其測(cè)定結(jié)果與凱氏定氮法的測(cè)定結(jié)果間的偏差見表8。蛋白濃度＜1.5 mg/mL時(shí),偏差＞96%,且兩法測(cè)定結(jié)果間的偏差隨測(cè)定樣品溶液蛋白濃度的減小而增大。因此,紫外吸收法雖有測(cè)定快速、樣品消耗少、樣品可回收、操作環(huán)境無特殊限制的優(yōu)點(diǎn),但不適于鱉甲水溶性蛋白含量的測(cè)定。

表8 紫外吸收法測(cè)定樣品中蛋白含量結(jié)果

4 討論

考馬斯亮藍(lán)G-250染色法、BCA測(cè)定法、紫外吸收法3種蛋白定量法都是根據(jù)一定波長(zhǎng)下,樣品吸光度的改變與蛋白濃度有直接的關(guān)系,從而測(cè)定相應(yīng)波長(zhǎng)下樣品吸光度的變化值可計(jì)算出樣品中蛋白濃度。這3種方法都是快速測(cè)定蛋白含量的方法,且分別與凱氏定氮法對(duì)比：考馬斯亮藍(lán)G-250染色法消耗少量樣品,用時(shí)短,操作簡(jiǎn)單,兩方法的測(cè)定結(jié)果差異大,原因可能是樣品中蛋白的堿性氨基酸殘基和芳香族氨基酸含量較少或與標(biāo)準(zhǔn)蛋白不同[12]；BCA測(cè)定法消耗少量樣品,用時(shí)極短,操作簡(jiǎn)單,兩方法的測(cè)定結(jié)果相近,兩法測(cè)定結(jié)果存在較小差異原因可能是樣品液中所含少量的雜質(zhì)、鈣離子、脂質(zhì)[13]、EDTA[14]等；紫外吸收法測(cè)定的樣品可完全回收,用時(shí)短,操作簡(jiǎn)單,兩方法的測(cè)定結(jié)果差異極大,原因可能是所測(cè)樣品中蛋白與標(biāo)準(zhǔn)蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差異太大[15],且樣品溶液中含的雜質(zhì)較多。

BCA法測(cè)定蛋白含量所用的試劑單一、產(chǎn)生復(fù)合物穩(wěn)定、不受TritonX-100及SDS等表面活性劑的影響,影響因素少且靈敏,在近些年的研究中體現(xiàn)出其優(yōu)勢(shì),有望替代最常用的Lowry法。本研究中BCA法測(cè)定結(jié)果與凱氏定氮法的測(cè)定結(jié)果間差異小,所以綜合以上,對(duì)比凱氏定氮法、考馬斯亮藍(lán)G-250染色法、紫外吸收法3種蛋白測(cè)定方法,當(dāng)鱉甲水提溶液中所含成分尚不明確的情況下,比較適合用BCA法對(duì)鱉甲水提溶液中蛋白含量進(jìn)行快速測(cè)定。目前鱉甲的活性成分尚未明確,可控指標(biāo)難以統(tǒng)一,但在鱉甲化學(xué)成分及抗肝纖維化等研究中,鱉甲藥材中的蛋白、多肽、氨基酸則至關(guān)重要,因此,鱉甲蛋白含量及其測(cè)定方法在鱉甲質(zhì)量控制的研究中必不可少。對(duì)于以蛋白含量作為評(píng)價(jià)鱉甲藥材質(zhì)量的指標(biāo),通過BCA法測(cè)定其蛋白含量的具體標(biāo)準(zhǔn)仍需進(jìn)一步深入研究。