藏藥康珠甘露口服固體前體脂質體的制備工藝優化研究

孟 達,毛 羽,林靈敏,卓小月,蔣孝龍

(西南民族大學 藥學院,四川 成都610041)

藏藥降糖復方(康珠甘露)是本課題組在傳統民族藥方劑基礎上化裁而來,用于二型糖尿病治療及心腦血管保護,康珠甘露總黃酮提取物(ZYZH)為其主要有效成分,ZYH為其中一種主要黃酮苷成分,為康珠甘露的評價指標和主要有效成分,其作用機制為對胰島β細胞的保護作用[1-3],增加胰島素的敏感性,改善胰島素抵抗及相關代謝紊亂[4,5]。

本實驗以ZYZH為原料開展深度研究,針對ZYZH溶解度低,首過效應明顯,口服生物利用度差的特點,將其制備成一種新型的前體脂質體制劑,使其不但具備脂質體的優點,并能克服傳統脂質體劑型貯存穩定性差的缺點[6-8],一方面可以提高藥物的溶出；另一方面最終增加ZYZH總黃酮在胃腸道的跨膜吸收和口服生物利用度。

本實驗在文獻和前期實驗研究基礎上,分別采用載體沉積法[9]和冷凍干燥法[10]制備藏藥康珠甘露總黃酮口服固體前體脂質體,以包封率為評價指標,采用單因素考察和正交試驗法,優化ZYZH前體脂質體制備工藝,并對兩種制備方法進行對比研究,為藏藥康珠甘露的后期制劑研究開發提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

AL104電子分析天平,英國malvern公司；JSM-7500F掃描電鏡,日本電子株式會社；MS-2000激光粒度分析儀,英國malvern公司；SENCO-R系列旋轉蒸發儀,上海申申科技有限公司；Waters2695高效液相色譜儀,美國Waters；FD-1冷凍干燥機,北京博醫康實驗儀器有限公司；KQ250B超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 藥品及試劑

ZYZH原料藥(由西南民族大學少數民族藥物研究所提供,含量≥60%)；ZYH對照品(由西南民族大學少數民族藥物研究所提供,批號20150508,經核磁和質譜鑒定,采用HPLC法測定,經面積歸一化法計算純度大于98%)；山梨醇、氯化鈉、乳糖、乙醇、磷酸緩沖鹽溶液(PBS)、海藻糖、蔗糖、膽固醇、氯仿、大豆卵磷脂、維生素E、磷酸氫二鉀、SephadexG-50、磷酸二氫鉀、三氯甲烷,以上試劑均為分析純,甲醇(色譜純),均由成都市科龍化工試劑廠提供。

2 方法與結果

2.1 載體沉積法制備ZYZH前體脂質體

取處方量載體粉末置于1 000 mL茄形瓶中,于旋轉蒸發儀上以80～90 rpm轉速、水浴恒溫40℃的條件,減壓預熱30 min。取處方量ZYZH原料藥、大豆卵磷脂、膽固醇適當超聲和溫熱使溶于適量有機溶劑(氯仿∶甲醇)中,以1.0 mL/min加入上述有機混合液,真空旋轉蒸發。有機混合液全部加入后,繼續旋轉蒸發30～40 min,將粉末置于真空干燥器中12h后過篩(40目),即得ZYZH前體脂質體。

2.2 冷凍干燥法制備ZYZH前體脂質體

稱取處方量大豆卵磷脂、膽固醇、ZYZH原料藥置于1 000 mL茄形瓶中,加入適量有機溶劑(氯仿∶甲醇),超聲使其充分溶解。于40℃水浴減壓蒸餾除去有機溶劑,形成均勻透明的薄膜,加入10 mL(PBS)作為水合介質進行洗脫,于40℃恒溫水浴水化2 h,水浴超聲30 min,得到乳狀半透明ZYZH脂質體懸浮液,密封置于4℃下冷藏保存。

采用冷凍干燥法制備前體脂質體。以甘露醇為凍干保護劑,利用制備得到ZYZH脂質體懸浮液,加入凍干保護劑濃溶液,使得混合后凍干劑質量分數為10%(由加入保護劑的質量除以混合液的體積計算得來),將其冷凍干燥即得ZYZH前體脂質體。得到的凍干樣品密封、避光,常溫保存于干燥器中。

2.3 ZYZH前體脂質體包封率的測定方法

按照本實驗前期所建立的SephadexG-50柱分離法,測定方法簡述如下：稱取一定量的Sap HadexG-50(100～200μm),用緩沖溶液室溫浸泡24 h后裝柱,精密吸取一定量脂質體樣品上樣,控制流速在0.8～1mL/min,用PBS洗脫,收集前10mL含脂質體的初洗脫液(a),另取與上樣量同體積的脂質體混懸液,用10 mL PBS稀釋,得未分離溶液(b)。分別取a、b溶液用無水乙醇稀釋至澄明,超聲破膜,進樣,測定其峰面積,根據標準曲線計算濃度和含藥量。a溶液測得的藥物濃度記作C包裹,b溶液測得的藥物濃度記作C總。

2.4 影響前體脂質體制備的因素考察

2.4.1 不同載體對載體沉積法制備ZYZH前體脂質體包封率的影響 固定其他因素不變,分別選用氯化鈉、山梨醇、乳糖為載體,制備前體脂質體,用PBS水合后測定其粒徑分布、Zeta電位及包封率。結果包封率分別為60.3%、62.1%、59.3%。表明載體為山梨醇時,制備的脂質體包封率最高。

2.4.2 進樣速度對載體沉積法制備ZYZH前體脂質體包封率的影響 固定其他因素不變,載體為山梨醇時：考察進樣速度分別為0.6 mL/min、1.0 mL/min、1.4 mL/min,制備ZYZH前體脂質體,用PBS水合后測定粒徑分布、Zeta電位及包封率。結果包封率分別為60.3%、62.1%、59.3%。結果表明,進樣速度為1.0 mL/min時,制備的脂質體包封率最高。

2.4.3 冷凍干燥法制備ZYZH前體脂質體時凍干保護劑的選擇 本實驗以凍干后外觀形狀、水合難易程度及包封率為指標對不同凍干保護劑,如山梨醇、乳糖、蔗糖及海藻糖制備的ZYZH前體脂質體進行了考察。結果以海藻糖、乳糖作為凍干保護劑制備的前體脂質體水合效果最優。

2.4.4 冷凍干燥法制備ZYZH前體脂質體時凍干保護劑量的考察 本實驗以凍干后外觀形狀、水合難易程度及包封率為指標考察了磷脂與凍干保護劑(w/w)不同比例制備的前體脂質體,比例分別為1∶2、1∶3、1∶4、1∶5、1∶6。結果表明,當卵磷脂與海藻糖的比例(w/w)為1∶4時所制得的前體脂質體包封率最高。

2.5 正交試驗優化

以包封率作為主要指標,結合單因素試驗結果,對水浴溫度(A),載脂比(w/w)(B),膽固醇與卵磷脂比例(w/w)(C),藥物與卵磷脂比例(w/w)(D),4個因素進行4因素3水平實驗,選用L9(34)正交表安排實驗,制備ZYZH前體脂質體,測定包封率。結果見表1。

表1 載體沉積法正交試驗結果

續表1 載體沉積法正交試驗結果

從表中可按極差R值大小排序,D＞B＞A＞C,即藥物與卵磷脂的質量比是影響包封率照A2B1C3D2組合制備的ZYZH前體脂質體,復水后的包封率為67.7%,優于其他組合的包封率。因此水浴溫度為40℃,進樣速度為1.0 mL/min、卵磷脂與載體的質量比為1∶4,卵磷脂與膽固醇的比例為5∶1,藥物與卵磷脂質量比為1∶10為最優處方。

以包封率作為主要指標,結合單因素試驗結果,對干燥工藝中凍干保護劑的用量(A)、預凍時間(B)及預凍溫度(C),3個因素進行3因素3水平實驗,制備ZYZH前體脂質體,并測定包封率。正交試驗結果如表2。

表2 冷凍干燥法正交試驗結果

從表中可知按極差R值大小排序,C＞B＞A,即預凍溫度是影響包封率的主要因素。且按照A1B3C2組合制備的ZYZH前體脂質體,復水后的包封率為62.1%,包封率優于其他組合。因此,卵磷脂與凍干保護劑的比例為1∶3,預凍時間為20 h,預凍溫度為－50℃,此為最優條件。

由表1、表2可以看出,采用山梨醇載體沉積法制備的ZYZH包封率大于冷凍干燥法制備前體脂質體的包封率。

2.5 驗證試驗

綜合對比工藝優化結果,山梨醇載體沉積法制備ZYZH前體脂質體優于冷凍干燥法。最終按山梨醇載體沉積法最優處方及工藝制備3批ZYZH前體脂質體,產品為淺黃色具一定流動性的粉末。測定其包封率分別為67.1%、67.5%、67.2%。由測定結果可知此處方和制備條件穩定可行。

2.6 ZYZH前體脂質體的質量評價

2.6.1 形態和粒徑 兩種方法所制備的ZYZH前體脂質體形態和粒徑,如表3所示。

表3 梨醇載體沉積法和冷凍干燥法制備的ZYZH前體脂質體形態和粒徑

綜上所述,實驗結果表明,載體沉積法在包封率、前體脂質體固體形態及水化后脂質體粒徑多方面指標均優于冷凍干燥法。

圖1 載體沉積法脂質體掃描電鏡

圖2 冷凍干燥法脂質體掃描電鏡

2.6.4 ZYZH前體脂質體初步穩定性考察 在ZYZH前體脂質體初步穩定性考察中,以外觀色澤、水合難易程度及水合后粒徑、pH值、包封率等為指標,考察了ZYZH前體脂質體在影響因素實驗、留樣實驗中的穩定性,通過60℃高溫試驗、4 000 LX強光照射試驗、4℃留樣考察以及25℃室溫留樣考察來研究ZYZH前體脂質體對溫度和光照強度的敏感性,以確保ZYZH前體脂質體的穩定性和用藥安全性、有效性。

按照最佳工藝制得的ZYZH前體脂質體為淺黃色、流動性良好的干燥顆粒,水合后成淺黃色脂質體混懸液。將此混懸液密閉冰箱4℃條件放置1、2、4、6個月后仍未見分層現象。同時將ZYZH前體脂質體在室溫密閉條件下放置1、2、4、6個月后,通過水合成混懸液并經透射電鏡和粒度分析儀檢測,結果具有良好的囊泡結果且粒徑分布均勻。此結果顯示冷藏環境下的ZYZH脂質體混懸液和室溫下的前體脂質體在放置6個月后,各參數值無明顯變化,說明所研制的ZYZH前體脂質體水合形成脂質體混懸液具有較好的穩定性。在60℃高溫條件及強光照射下,會使脂質體少許結塊,水合難度相應增加。建議將ZYZH前體脂質體置于室溫(25℃)或低溫、避光保存。

3 討論

降糖藏藥康珠甘露總黃酮水溶性差,口服具有首過效應,如何提高黃酮苷類天然藥物的生物利用度,一直是藥劑學領域的一個難題,為了提高其口服生物利用度,本實驗采用前體脂質體技術制備了一種新型的口服ZYZH固體前體脂質體給藥系統,以提高ZYZH的生物利用度。前體脂質體在運輸、儲存的過程中比起普通脂質體有更好的穩定性,可減少聚集、融合及藥物滲漏,但不同制備方法制備的脂質體質量不同,本實驗采用載體沉積法和冷凍干燥法制備ZYZH前體脂質體,以外觀、水合難易及包封率為指標對兩種制備方法進行了綜合比較分析,結果顯示載體沉積法制備的前體脂質體總體結果較好。最終選用載體沉積法制備ZYZH前體脂質體。通過單因素篩選及正交試驗確立了載體沉積法的最佳處方為卵磷脂與載體的質量比(w/w)為1∶4,卵磷脂與膽固醇的質量比(w/w)為5∶1,藥物與卵磷脂質量比(w/w)為1∶10,PBS的pH值為7.0。并確定了相應最佳制備工藝,本課題首次采用藏藥降糖復方(康珠甘露)有效部位提取物(總黃酮,ZYZH)進行了治療糖尿病的前體脂質體制劑的研究,成功制得了工藝合理可行、質量穩定可控的ZYZH前體脂質體。

在體外分析方法的建立過程中,本研究選用其中一種主要藥效成分ZYH為指標并對其建立了有效、可行的含量測定方法。但中藥復方的藥效作用是由多種有效成分相互影響而發揮的,選用一種指標成分進行測定并不能全面反映所制備的制劑質量可控性。后續工作應對處方中其他有效成分進行系統分析,建立多指標成分的體外分析方法。

在制備工藝方法篩選過程當中,雖然本實驗綜合對比結果表明載體沉積法優于冷凍干燥法,但載體沉積法在工業化生產中有一定難度,且復水程度較冷凍干燥法差,兩種方法各有其優缺點。本實驗的目的在于通過載體沉積法制備工藝的優化進而為以后的中試及工業生產提供理論指導。

由于時間關系,后續將進一步完善其藥動學研究,并考察其在體內外的釋放、吸收及分布規律,目前本課題組正在開展生物等效性研究和長期影響因素試驗。