消栓健腦沖劑對大鼠腦缺血模型的保護作用及機制研究

孫麗娜,廉治軍

(1.遼寧中醫藥大學 研究生學院,遼寧 沈陽110847；2.大連皮膚病醫院,遼寧 大連116021)

腦缺血病是指血管破損或堵塞而引起腦組織缺血缺氧,從而導致腦組損傷的臨床疾病,又稱中風,分缺血性和出血性腦缺血[1]。當腦組織出現缺血缺氧時導致腦細胞死亡,輕則損傷神經功能,引起知覺、感覺的喪失,重則引起癱瘓、死亡,該病已經成為威脅人類健康的危急疾病。中醫藥在防治腦缺血病中有特殊優勢,本次實驗主要觀察消栓健腦沖劑大鼠腦缺血模型腦梗死面積和腦含水量的作用,探討其對腦組織的保護作用及作用機制,為中醫藥防治腦缺血病提供科學的實驗依據。

1 實驗材料

1.1 實驗動物與用藥

本次研究使用SD雌性大鼠9只,6～8周齡,體重260±20g。

消栓健腦沖劑的制備：按大鼠等效劑量相當于人的6.3倍計算,大鼠100g/d用藥量為[2]：當歸0.63g、黃芪0.63g、刺五加0.63g、伸筋草0.315 g、姜黃0.315 g、紅花0.315 g、川芎0.63g,將顆粒藥物加20mL水,混合備用。

1.2 實驗儀器與試劑

實驗儀器與試劑如表1、表2所示。

表1 實驗所用主要儀器

表2 主要試劑及其生產公司

2 實驗方法

2.1 動物分組與建立模型

將9只大鼠隨機分為空白組、模型組和實驗組。將模型組和實驗組大鼠用10%水合氯醛按3.5 mL/kg腹腔注射麻醉后,仰臥安置于手術臺,頸正中偏右切口,分離右側頸總動脈、頸外動脈、頸內動脈,結扎頸外動脈及其分支,于頸總動脈近心端處用針頭穿刺一小口,由此處輕輕插入準備好的魚線,平均深度為22.0±2.0mm。魚線從頸總動脈插入經頸內動脈分叉輕輕進入顱內至大腦前動脈,其深度恰好阻斷大腦中動脈血流,固定魚線,打開頸外動脈分支,縫合頸部皮膚。空白組大鼠頸正中偏右切口后縫合頸部皮膚[3]。

2.2 給藥方法

按大鼠胃容量0.875mL/100g,連續灌胃14d,3次/d。模型組大鼠給生理鹽水,實驗組大鼠按0.4g/kg給消栓健腦沖劑,空白組不做處理。14d后麻醉各組大鼠后,分離腦組織。

2.3 實驗檢測方法

2.3.1 TTC染色檢測腦梗死體積方法 將大鼠腦組織用生理鹽水沖洗干凈后,至于－20℃冷凍30 min左右,30min后把腦組織放置于冰盒上,將整個腦(右側蒼白區域)冠狀切成1mm厚的薄片5片(肉眼觀察整個腦,右側梗死部位比其他部位蒼白),將5片薄片放入1%TTC染液中(PBS配制,注意避光),37℃染15 min,期間不斷翻動切片,保證切片均勻著色。著色均勻后用數碼相機照相,并用軟件計算梗死面積百分比。

2.3.2 測定大腦含水量方法 切除大鼠小腦與左腦,用濾紙將血吸干后稱取右側大腦濕重,然后將右腦置于培養皿中,置于恒溫培養箱中烘干72 h,至右腦完全烘干、最后稱取大腦干重,測定大腦含水量：腦含水量(%)＝(濕重－干重)/濕重×100%。

2.4 統計學方法

使用SPSS 20.0統計學軟件處理數據,計量資料以(±s)表示,組間以t檢驗和單因素方差分析方法進行統計處理。P＜0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 TTC染色檢測腦梗死面積結果

大鼠腦梗死面積比較：空白組大鼠雙側腦組織均紅染,無梗死面積,與空白組比較,模型組和實驗組腦梗死面積明顯增大(P＜0.01)；與模型組比較,實驗組腦梗死比較明顯減少(P＜0.01),實驗結果表明消栓健腦沖劑能夠明顯減少腦組織梗死面積,起到保護腦組織的作用見。見表3、圖1。

表3 各組大鼠腦梗死面積結果比較 (±s,%)

表3 各組大鼠腦梗死面積結果比較 (±s,%)

注：與空白組比較,?、＃P＜0.01；與?比較,＃＜0.01。

組別 梗死面積空白組 0模型組 45.24±0.48?實驗組 34.21±0.79＃

圖1 各組大鼠腦梗死面積比較

3.2 測定大腦含水量結果

大腦濕重比較,與空白組比較,模型組和實驗組大腦濕重均明顯降低(P＜0.05)；與模型組比較,實驗組大腦濕重明顯降低(P＜0.05)。大腦干重比較,與空白組比較,模型組明顯降低(P＜0.01),實驗組無差異(P＞0.05),與模型組比較,實驗組大腦濕重明顯降低(P＜0.01)。大腦含水量比較,與空白組比較,模型組明顯降低(P＜0.05),實驗組無差異(P＞0.05),與模型組比較,實驗組大腦濕重明顯降低(P＜0.05)。實驗結果表明消栓健腦沖劑能夠明顯抑制腦缺血后腦水腫的發生和發展。

表4 各組大鼠腦含水量結果比較 (±s)

表4 各組大鼠腦含水量結果比較 (±s)

注：與▽比較,?、＃P＜0.05,與? 比較,＃P＜0.05；與▽▽比較,??P＜0.01,＃＃P＞0.05,與??比較,＃＃P＜0.01；與▽▽▽比較,△P＜0.05,▲P＞0.05,與△比較,▲P＜0.05。

組別 濕重(g) 干重(g) 含水量(%)空白組 0.720±0.232▽ 0.167±0.242▽▽ 76.81±0.210▽▽▽模型組 0.672±0.531? 0.137±0.651?? 79.61±0.556△實驗組 0.692±0.126＃ 0.160±0.351＃＃ 76.88±0.326▲

4 討論

腦梗死面積評價是判定腦梗缺血、腦梗死程度和預后最直接的方法。TTC是檢測腦缺血常用的方法,TTC是呼吸鏈中吡啶－核苷結構酶系的質子受體,為脂溶性光敏復合物,能夠通過氧化酶系反應,將正常的腦組織由無色染為紅色,而缺血梗死的腦組織酶活性降低,不能誘導其發生染色反應而為白色,因此,通過TTC染色反應可以觀察腦組織中正常和損傷、壞死部分[4]。本次研究中空白組腦組織雙側半球均為均一色紅染,無梗死灶；模型組和實驗組大鼠腦組織梗死面積較空白組明顯增大,變成均出現不同程度的腦梗死(P＜0.01),而實驗組大鼠腦梗死面積較模型組明顯減少(P＜0.01),說明消栓健腦沖劑能夠明顯抑制腦細胞、腦神經損傷,對腦組織起到明顯的保護作用。

腦水腫即體液異常聚集于腦實質中,引起腦細胞、組織腫脹,是腦缺血病常見的病理變化之一,能夠嚴重影響腦神經的功能和修復,嚴重威脅生命健康安全[5]。腦水腫主要是因為腦細胞和腦組織出現缺血后,血腦屏障被損壞,血漿從腦血管滲透到細胞外間隙引發水腫。腦含水量的測定可以反應腦水腫的程度,本次研究發現模型組大鼠腦水腫程度要明顯高于空白組和實驗組(P＜0.05),表明模型組大鼠腦組織存在明顯的水腫,而實驗組大鼠腦組織含水量和空白組沒有明顯差異(P＞0.05),結果說明消栓健腦沖劑能夠明顯消除腦組織水腫,保護腦細胞和腦組織。

本次研究表明消栓健腦沖劑對大鼠模型的腦組織起到明顯的保護作用,其組成為：當歸、黃芪、紅花、川芎、刺五加、伸筋草、姜黃,方中當歸補血活血,祛瘀而不傷血；黃芪健脾補氣,氣血化生有源,血隨氣行,祛瘀活血而不傷正氣,二者共為君藥；紅花、川芎二藥行氣補血,活血化瘀,助黃芪補氣行氣之功、當歸補血活血化瘀之效；佐藥刺五加、伸筋草活血脈,活血通絡,祛瘀止痛；姜黃破血行氣、通經止痛,善引藥上行,為使藥,諸藥合用共行補氣行氣、活血化瘀之功。

腦缺血病的發病和治療機制、過程很復雜,本次實驗通過建立大鼠腦缺血模型,觀察消栓健腦沖劑對大鼠腦組織梗死、缺血面積和腦含水量的影響,結果表明消栓健腦沖劑能夠改善大鼠腦組織損傷狀態,為下一步研究奠定基礎。