基于VEGF/FGF血管生成因子及TNF因子表達研究鶴草茶束胎的功效與機制

馮翮飛,郭 濤,黃 敏,蘇 旺,夏得月,杜青青,楊 帆,劉佳敏,張曉宇,孫 杰,吳藝舟

(1.南京醫科大學 護理學院,江蘇 南京211166；2.南京醫科大學第一臨床醫學院,江蘇 南京211166；3.南京醫科大學 口腔醫學院,江蘇 南京211166；4.南京醫科大學 兒科學院,江蘇 南京211166；5.南京醫科大學 公共衛生學院,江蘇 南京211166；6.南京醫科大學 基礎醫學院,江蘇 南京211166)

仙鶴草(Agrimonia pilosaLedeb.)屬薔薇科植物,別名龍牙草、脫力草、瓜香菜,是我國滇南地區的常食野菜,也是深受美國和加拿大等國家歡迎的花草茶。仙鶴草全草含有三萜皂甙與類黃酮[1],烏索酸、果膠酸、均苯三甲酸、科羅索酸等植物多酚與有機酸[2,3],仙鶴草素等活性成分,以及少量鞣質、揮發油、維生素和人體必需微量元素[4]。仙鶴草的干燥地上部分是我國一味傳統草藥,性苦、澀,味平,歸心、肝經,具有收斂止血、截瘧止痢、解毒補虛的療效,可用于咯血、吐血、崩漏下血、瘧疾、血痢、癰腫瘡毒、陰癢帶下、脫力勞傷的治療(參見《中國藥典(2015版)》)。當代研究發現,仙鶴草提取物對氧化應激損傷具有很好的保護作用,具有抗氧化和醛糖還原酶抑制活性[5-7],是很好的天然抗氧化劑及功能性食品開發資源[8]。也有研究證實,仙鶴草不同提取物在動物試驗中呈現良好的收斂止血、抗菌以及鎮痛作用[9-11],其作用機制與清除自由基有關[11,12]。

隨著我國物質生活水平的提高,我國巨大兒發生率呈不斷上升趨勢。根據2006年的統計數據顯示,我國東、中、西部巨大兒發生率分別為8.2%、5.9%、5.2%,分娩巨大兒對母嬰均有危害,孕婦產前肥胖、糖尿病史、過期妊娠、高齡產婦等均為巨大兒發生的高危因素[13]。巨大兒的發生與營養、遺傳、心理因素均有關,因此單純控制孕婦飲食,并不能絕對避免巨大兒的發生。目前,如何降低巨大兒發生率已成為亟待解決的婦產科難題。中醫自古既有束胎的治療方案,《金匱鉤玄》《女科指掌》《本草綱目》等中醫古籍中均有束胎、縮胎易產的記載。本課題組在前期研究發現,仙鶴草的提取物在動物實驗中呈現束胎功效,且無明顯毒副作用,其發揮束胎功效的機制尚不明確。

一般來說,對血管生長具有調節作用的化合物多可影響動物胚胎血管的新生過程。青蒿等與仙鶴草具有相似抗瘧活性的中草藥,其所含多個天然藥物成分均具有調控嚙齒類胚胎血管新生進而影響胚胎發育的作用[14,15]。仙鶴草具有止血止瀉的功效,提示其束胎功效可能與調控胚胎血管及機體炎癥發生的過程有關。本次試驗以ICR孕鼠為模型,研究鶴草茶的束胎功效,以及其束胎過程中對鼠胚組織中血管表皮生長因子(VEGF)、纖維母細胞生長因子(FGF)、腫瘤壞死因子(TNF)、雌激素受體(ER)表達的影響,初步揭示仙鶴草束胎作用的分子機制。

1 材料與方法

1.1 鶴草茶制備

用于本研究的仙鶴草由南京同仁堂藥業有限責任公司提供。將仙鶴草分別以60、80、100mg/mL浸沒于沸騰蒸餾水,維持溶液沸騰狀態5 min,封閉容器至室溫,浸提5h,過濾除去殘渣,所得浸提液作為供試溶液。

1.2 抗體與試劑

Rabbit Anti-FGF1和Rabbit Anti-TNF-α抗體購自北京博奧森生物技術有限公司,孵育濃度1∶300；Rabbit Anti-VEGF抗體購自武漢博士德生物工程有限公司,孵育濃度1∶50,一抗－40℃保存。即用型SABC-AP(Strept Avidin-Biotin-enzyme Complex)試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司,4℃保存,操作方法參見產品說明書。Poly-L-Lysine(Sigma)處理載玻片、0.01 mol/mL PBS(pH7.2～7.4)緩沖液配置、0.01mol/mL枸櫞酸鹽緩沖液的配制參照常規。

1.3 實驗動物

8周齡ICR小鼠購自南京醫科大學實驗動物中心,實驗動物生產許可證號為SCXK(蘇)2016-0002。體重范圍雌鼠21～23g,雄鼠23～25g。實驗動物飼養于溫度20～26℃、相對濕度40%～70%的屏障環境中,實驗動物使用許可證號：SYXK(蘇)2015-0009。輻照滅菌飼料由江蘇省協同醫藥生物工程有限責任公司提供,生產許可證：蘇飼證(2014)01008。實驗動物檢疫合格后,每天檢查雌鼠發情期狀態,將發情期雌鼠與雄鼠1∶1交配過夜,次日清晨檢查精栓并分籠,發現精栓的當天記為受孕0.5 dpc(days postcoitum)。

1.4 束胎實驗

ICR孕鼠40只,隨機分為高、中、低鶴草茶組與對照組,共4組。鶴草茶組孕鼠自受孕8.5dpc起,分別以每日新鮮制備的60、80、100 mg/mL鶴草茶替代飲用水,試驗期間孕鼠自由攝食攝水,每日觀察體征與死亡情況,記錄各組飲水量。同期攝入蒸餾水孕鼠為空白對照組。胎仔出生當天記作1.0 dpp(days postpartum),記錄并比較各組孕鼠的平均產仔時間、平均產仔數、平均仔重、仔鼠存活率、21 dpp平均斷乳體重以及斷乳存活率。

1.5 中期樣本的采集

各組孕鼠于13.5dpc時隨機處死一半,迅速進行大體解剖觀察并統計各組活胎、死胎與吸收胎數量。剝離的完整鼠胚,使用0.01 mol/mL PBS配制的4%多聚甲醛固定1 h,經(30±1)%～(98±1)%乙醇梯度脫水后,二甲苯透明兩次,包埋于58℃低熔點石蠟中。使用LEICA RM2235石蠟切片機制備7μm組織切片,4℃保存。

1.6 免疫組織化學

組織切片于60℃下烘烤2 h,經二甲苯浸透除蠟,(98±1)%～(30±1)%乙醇梯度復水各15 min,枸杞酸鹽緩沖液100℃抗原修復10min,一抗37℃孵育1.5 h,二抗37℃孵育30 min,BCIP/NBT顯色20min,核固紅染料輕度復染0.5min。

組織圖像使用Image-Pro Plus 6.0軟件學分析。每個胚胎取4張組織切片檢測,選擇陽性顯色點,分別統計鼠胚腦、內臟、脊椎部位整視野下切片的平均顯色點面積(area)、平均光密度(density)和累計光密度值 (integrated optical density,IOD)。

1.7 統計數據分析

2 結果與分析

2.1 鶴草茶攝入量

攝入60～100mg/mL仙鶴草制備的浸提物后,各組孕鼠未見明顯異常體征,100 mg/mL鶴草茶組部分孕鼠于妊娠后期出現緩動、嗜睡癥狀。鶴草茶攝入曲線(圖1A)結果顯示,各濃度鶴草茶組孕鼠在8.5～9.5 dpc時段內的平均水分攝入量均高于空白對照組(＝5.00 mL/d),80 mg/mL組與100mg/mL組孕鼠在攝入鶴草茶24h內出現水分攝入高峰(＝11.25 mL/d)；24 h之后60mg/mL組與80 mg/mL組的日均水分攝入量高于空白對照組,100 mg/mL組(＝3.75 mL/d)低于空白對照組,而60 mg/mL組的鶴草茶日均攝入量與空白對照組相比,差異較小。

8.5～1 9.0dpc時段的鶴草茶的日均攝入量(圖1B)結果顯示,各濃度鶴草茶組孕鼠與對照組孕鼠相比,雖總水分攝入量略高,但無統計學差異(P＞0.05)。根據各組孕鼠實際日均攝入量換算,則60mg/mL、80mg/mL、100mg/mL鶴草茶組孕鼠每日實際鶴草茶攝入量分別為(348±46.2)mg、(572.8±200.8)mg、(632±359)mg(以制備浸提液的仙鶴草干重計)。

2.2 胚胎發育

各試驗組一半孕鼠于13.5dpc時使用CO2處死,各試驗組孕鼠大體解剖觀察均未見明顯臟器病變或異常,胚胎發育指標見表1。鶴草茶各劑量組孕鼠與對照組孕鼠相比,平均胎數未見顯著差異(P＞0.05),且在妊娠期間均未發生死胎、吸收胎及發育異常。

Tab 1. Embryonic development index

Fig 1. Analysis on intake of Crane Tea

2.3 胎仔發育指標

在8.0～18.0 dpc致畸敏感期內給予孕鼠60～100mg/mL仙鶴草制備的浸提物,與對照組相比,未對孕鼠產仔時間產生顯著影響,各組別孕鼠產仔時間均為18.5～19.0 dpc。各試驗組間平均胎仔數指標無統計學差異(P＞0.1),60～100 mg/mL鶴草茶組胎仔的平均體重指標均低于對照組,80mg/mL鶴草茶組與100mg/mL鶴草茶組胎仔平均體重的降低與對照組相比,差異有統計學意義(P＜0.05),60～100 mg/mL鶴草茶對胎仔存活率無影響,各鶴草茶組胎仔均未見異常體征(表2)。

Tab 2.1 dpp Fetal development index

21 dpp胎仔離乳時(表3),60～100mg/mL鶴草茶組胎仔的平均離乳體重均低于對照組(P＜0.01),且呈劑量效應。60 mg/mL鶴草茶組胎仔圍產期存活率未受影響,而80～100mg/mL鶴草茶組胎仔在21 dpp哺乳期間存活率下降,其中,100 mg/mL鶴草茶組胎仔與對照組相比存活率降低了11.4%。

Tab 3.21 dpp Fetal development index

2.4 胚胎中細胞因子的表達

實驗動物圍產期數據顯示,給予孕鼠60～80 mg/mL鶴草茶具有明確的束胎功效,且未見顯著毒性作用。進一步采用石蠟切片免疫組化方法,對80 mg/mL鶴草茶組胚胎進行VEGF、FGF、TNF、ER表達水平檢測,圖片數據使用Image-Pro Plus 6.0程序intensity光密度反向條件下,選擇陽性顯色點區域,統計×64顯微視野下平均顯色點直徑Area(mean),組間各細胞因子的免疫顯色識別區平均面積(Area)無統計學差異。

各細胞因子免疫組化結果顯示,80 mg/mL鶴草茶組小鼠胚胎中的VEGF(P＜0.01)、FGF(P＜0.05)和TNF(P＞0.05)的平均表達水平均高于對照組(圖2 A-C),但ER表達水平未見顯著影響(P＞0.05)。

Fig 2. Cytokine expression in embryos

3 結論

本研究結果證實鶴草茶具有束胎功效,以60～100 mg/mL仙鶴草制備的浸提物均可減低胎仔出生時的平均體重,其中,80～100mg/mL鶴草茶組胎仔平均體重與對照組相比,有統計學差異(P＜0.05)。100 mg/mL鶴草茶組孕鼠于妊娠后期出現緩動、嗜睡癥狀,雖該組別仔鼠21 dpp離乳存活率下降明顯,但在孕中期解剖過程中未見死胎與吸收胎,部分體重較輕仔鼠于哺乳期間死亡,此結果可能與體重較輕仔鼠難以爭得足夠乳汁有關。因此,60～80 mg/mL仙鶴草制備的浸提物為相對安全的動物束胎試驗劑量濃度。

以80 mg/mL鶴草茶組孕中期胚胎制作石蠟切片,對抗炎與調控血管新生相關細胞因子進行免疫組化分析,結果顯示,孕鼠攝入80 mg/mL仙鶴草制備的浸提物后,胚胎中VEGF(P＜0.01)及FGF(P＜0.05)表達水平與對照組相比顯著升高。VEGF是機體創傷后自愈修復的關鍵因子,具有促進新生血管表皮細胞生長、增加血管通透性等作用。外源性NO誘導、內皮細胞和iNOS的過度表達均可增加特定病理組織中的VEGF濃度[16]。VEGF在經信號分子激活后,與三種VEGFR結合,激活VEGFR的酪氨磷酸化位點,啟動信號級聯效應[17]。FGF是組織再生的標志性細胞因子,具有廣泛的生物學活性,通過與酪氨酸激酶受體、輔因子HS(HSPG)結合形成FGF-FGFR-HS復合物,經酪氨酸殘基磷酸化激活后參與包括RAS-MAPK、PI3K-AKT、PLCγ和STAT途徑在內的細胞內信號傳導途徑偶聯[18]。本研究結果提示,鶴草茶的束胎功效涉及機體創傷修復過程,與調控血管新生相關蛋白因子的表達有關。仙鶴草富含皂苷,其總皂苷對黏膜的刺激性,是鶴草茶誘發機體創傷修復的相關因子表達的可能原因。

研究進一步采用免疫組化方式,對80 mg/mL鶴草茶組孕中期胚胎中的TNF和ER表達水平進行了分析。TNF是由激活的巨噬細胞產生的能抑制成骨細胞和刺激破骨細胞的細胞因子,研究發現雌激素性股骨頭壞死患者血清中的TNF表達水平顯著升高[19],TNF也可直接殺傷腫瘤細胞而對正常細胞無明顯毒性,具有良好的抗炎與鎮痛作用[20],是仙鶴草中類黃酮發揮抗炎抗氧化作用可能的靶標因子。本研究結果證實,鶴草茶可以提高80 mg/mL實驗組胚胎中的TNF表達,但與對照組相比,無統計學差異(P＞0.05),而對ER表達水平沒有影響。由于TNF在組織中的含量較低,因此雖本次試驗中TNF升高的統計學意義不顯著,但尚不能否定鶴草茶導致胚胎TNF表達升高所具有的生物學意義。