杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法在稻米蛋白質(zhì)檢測中的對比研究

秦琳 黃世群 仲伶俐 付成平 周虹 趙珊 向冰 雷紹榮

（四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院分析測試中心，成都610066；第一作者：QinlinL＠126.com；*通訊作者：leishaorong2004＠163.com）

稻米是我國的傳統(tǒng)主食，其主要成分是淀粉和蛋白質(zhì)，在含水量為14%的稻米中，淀粉和蛋白質(zhì)含量分別為76.7%～78.4%和6.3%～7.8%[1-2]。稻米蛋白質(zhì)是優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，必需氨基酸種類豐富，其生物價(jià)值、蛋白質(zhì)利用率等均高于小麥蛋白和玉米蛋白，是決定稻米營養(yǎng)品質(zhì)的主要指標(biāo)[3-8]。目前，稻米蛋白質(zhì)含量的測定方法主要為凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法，其中，凱氏定氮法是檢測蛋白質(zhì)含量的標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法，其準(zhǔn)確度高、重現(xiàn)性好。但采用凱氏定氮法時(shí)，需要大量化學(xué)試劑（如濃硫酸、氫氧化鈉溶液和硼酸溶液等），不僅加大了檢測成本，且嚴(yán)重污染環(huán)境，對實(shí)驗(yàn)員健康存在潛在危害[9-10]。相比之下，杜馬斯燃燒法具有環(huán)保和高效的優(yōu)勢，已被歐美、日本等發(fā)達(dá)國家在多個(gè)行業(yè)采用[11-12]。近幾年來，在我國也逐漸被應(yīng)用到如谷類、豆類粗蛋白質(zhì)含量的測定中（NY/T 2007-2011[13]）。其測定原理是試樣在純氧（≥99.99%）環(huán)境中高溫燃燒，燃燒過程中產(chǎn)生混合氣體，其中的碳、硫等干擾氣體和鹽類被吸收管吸收，氮氧化物被全部還原成氮?dú)猓纬傻牡獨(dú)鈿饬魍ㄟ^熱導(dǎo)檢測器（TCD）進(jìn)行檢測[14]，再乘以相應(yīng)的轉(zhuǎn)換系數(shù)得到蛋白質(zhì)含量。

近幾年來，國內(nèi)關(guān)于杜馬斯燃燒法測定飼料粗蛋白[10，15]、油料粗蛋白[16]、土壤全氮[17-18]和食品（奶粉、牛奶、黃豆、肉類、人參等）中蛋白質(zhì)含量[9，19-21]的研究較多，結(jié)果表明杜馬斯燃燒法可以作為測定飼料、油料和食品中蛋白質(zhì)含量的常規(guī)檢測方法；但用于測定土壤全氮時(shí)，含氮量較低的土壤樣品測定結(jié)果準(zhǔn)確度要低于凱氏定氮法[18]。杜馬斯燃燒法用于稻米蛋白質(zhì)的檢測報(bào)道較少，為此，本試驗(yàn)采用杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法同時(shí)對40個(gè)精米和10個(gè)糙米樣品的蛋白質(zhì)含量進(jìn)行檢測，通過對兩種方法測定結(jié)果的精密度、準(zhǔn)確度和相關(guān)性及檢測成本進(jìn)行比較分析，探討杜馬斯燃燒法用于稻米蛋白質(zhì)檢測的可行性，以期為準(zhǔn)確、高效測定稻米蛋白質(zhì)含量提供方法參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

40個(gè)精米和10個(gè)糙米樣品由農(nóng)業(yè)農(nóng)村部食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)測試中心（成都）提供，為2018年不同水稻主產(chǎn)區(qū)生產(chǎn)的水稻產(chǎn)品。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器

rapid MAX N EXCEED型元素分析儀，德國Elementar公司生產(chǎn)；FOSS2400全自動(dòng)凱氏定氮儀、消化爐，瑞典FOSS公司生產(chǎn)；AUY 220電子天平，日本島津公司生產(chǎn)，精度為0.1 mg。

1.2.2 試劑與氣體

濃硫酸；催化劑（K2SO4∶CuSO4·5H2O=10∶1）；10 g/L硼酸溶液；400 g/L氫氧化鈉溶液；0.05 mol/L鹽酸標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液，按照GB/T 601-2016《化學(xué)試劑 標(biāo)準(zhǔn)滴定溶液的制備》規(guī)定配制并標(biāo)定；0.1%甲基紅乙醇溶液；0.1%溴甲酚綠乙醇溶液；氧化銅和Pt催化劑；ESAREGAINER；氧化鋁；五氧化二磷；氧氣（純度≥99.99%）；氦氣（純度≥99.99%）；標(biāo)準(zhǔn)品：硫酸銨，含 N 21.21%，純度≥99.99%，天津市光復(fù)精細(xì)化工研究所生產(chǎn)；天冬氨酸，含 N 10.52%，純度≥98%（HPLC），SIGMA公司生產(chǎn)。

1.3 測定方法

1.3.1 凱氏定氮法

稱取待測樣品約0.4 g（準(zhǔn)確至0.0001 g）于消化管中，加入 5 g 催化劑（K2SO4∶CuSO4·5H2O=10∶1）和 10 mL濃硫酸，搖勻，在消化爐上420℃消化約1 h，待消煮液呈亮綠色并澄清透明后取下，冷卻后緩慢加入約20 mL水。待液體冷卻后，置于FOSS 2400全自動(dòng)凱氏定氮儀上進(jìn)行加堿蒸餾3.5 min，將試樣中的氨通過冷凝由硼酸溶液直接吸收，并用鹽酸標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定硼酸吸收液，記錄鹽酸滴定體積，計(jì)算樣品中蛋白質(zhì)含量。每個(gè)樣品重復(fù)測定3次，同時(shí)做5份空白測定。分別稱取硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品 20.0、30.0、40.0、50.0 和 60.0 mg，進(jìn)行蒸餾滴定，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.2 杜馬斯燃燒法

采用rapid MAX N EXCEED型元素分析儀進(jìn)行測定。稱取待測樣品約300 mg（精確至0.1 mg）于坩堝中，置于自動(dòng)進(jìn)樣盤內(nèi)，在燃燒爐溫度達(dá)900℃以上、次級燃燒管溫度達(dá)900℃以上、還原管溫度達(dá)600℃以上、氧氣（純度≥99.99%）壓力達(dá)0.25 MPa、氦氣（純度≥99.99%）壓力達(dá)0.38 MPa，儀器自動(dòng)進(jìn)樣檢測，加氧時(shí)間為120 s，加氧流速為300 mL/min。每個(gè)樣品做3次重復(fù)測定，同時(shí)做5份空白測定。分別稱取天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì) 50.0、100.0、150.0、200.0 和 250.0 mg，上機(jī)檢測，得標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用DPS統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析和多重比較，采用Excel軟件進(jìn)行線性回歸分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法的精密度及質(zhì)量控制比較

圖1 凱氏定氮法含氮量標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖2 杜馬斯燃燒法含氮量標(biāo)準(zhǔn)曲線

凱氏定氮法測定稻米蛋白質(zhì)時(shí)，稱取不同質(zhì)量硫酸銨標(biāo)準(zhǔn)品，以稱樣量為橫坐標(biāo)、總氮含量為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。總氮含量范圍為4.11～12.5 mg，標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=0.2104 x-0.072，R2=0.9998（圖 1）。采用杜馬斯燃燒法時(shí)，稱取天冬氨酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，以總氮含量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。總氮含量范圍為5～25 mg，標(biāo)準(zhǔn)曲線為 y=2638.9 x+299.3，R2=1（圖 2）。由此可見，兩種方法測定標(biāo)準(zhǔn)品時(shí)，方法穩(wěn)定，且回收率較高。

分別用凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定了全麥粉和糙米標(biāo)準(zhǔn)品的蛋白質(zhì)含量、乙酰苯胺標(biāo)準(zhǔn)品的全氮含量，每個(gè)樣品重復(fù)測定6次。從表1可看出，兩種方法測定的全麥粉蛋白質(zhì)含量和乙酰苯胺全氮含量結(jié)果相同，凱氏定氮法測定的糙米蛋白質(zhì)含量與杜馬斯燃燒法接近；兩種方法測定的糙米蛋白質(zhì)含量均低于標(biāo)準(zhǔn)品真實(shí)值，回收率分別為99.0%和99.2%。比較兩種方法的RSD和RE值，可確定杜馬斯燃燒法具有較高的精密度，且準(zhǔn)確度良好。

表1 凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定3種標(biāo)準(zhǔn)品的全氮含量的結(jié)果（n=6）

2.2 杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法測定稻米蛋白質(zhì)含量比較

用凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定了40個(gè)精米和10個(gè)糙米樣品中的蛋白質(zhì)含量。從表2可見，凱氏定氮法測定的40個(gè)精米樣品的蛋白質(zhì)含量范圍為5.31%～7.39%，10個(gè)糙米樣品的蛋白質(zhì)含量范圍為6.43%～7.83%，杜馬斯燃燒法測定的40個(gè)精米樣品和10個(gè)糙米樣品的蛋白質(zhì)含量范圍分別為5.27%～7.35%和6.40%～7.89%；凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定的精米樣品結(jié)果比值（K/D）為0.996～1.036，糙米樣品為0.993～1.023。由此可見，兩種方法對精米和糙米樣品的檢測表現(xiàn)出一致性。對兩組數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析，可以看出兩種方法測定結(jié)果有29個(gè)樣品存在顯著性差異，其中有28個(gè)樣品的杜馬斯燃燒法測定結(jié)果低于凱氏定氮法（偏低的范圍為0.005%～0.035%），這表明采用杜馬斯燃燒法測定稻米蛋白質(zhì)含量其結(jié)果較凱氏定氮法偏低。這可能是其檢測步驟與凱氏定氮法不同所致。首先杜馬斯燃燒法是通過將試樣在純氧（≥99.99%）環(huán)境中高溫徹底燃燒，再根據(jù)熱導(dǎo)檢測器檢測產(chǎn)生氮?dú)鈿饬髁縼頊y得準(zhǔn)確的氮含量，而凱氏定氮法檢測氮含量需經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定量來算出，滴定終點(diǎn)以顏色判斷，由于儀器靈敏度不同，可能會(huì)因酸滴定過量而使得檢測值偏高；其次杜馬斯燃燒法檢測過程從進(jìn)樣到出結(jié)果是在完全密閉的系統(tǒng)中完成的，而凱氏定氮法的樣品在稱樣后需經(jīng)消煮、蒸餾和滴定，這3個(gè)過程不是在完全密閉和連續(xù)的體系中完成，可能存在NH3污染使得測定結(jié)果較凱氏定氮法稍高。

由圖3和圖4可看出，精米和糙米樣品用凱氏定氮法測定結(jié)果的變異系數(shù)分別為0.02%～1.70%和0.20%～1.50%，杜馬斯燃燒法測定結(jié)果的變異系數(shù)分別為0.01%～0.80%和0.01%～1.10%，兩種檢測方法變異系數(shù)均小于5%，穩(wěn)定性都很高。但相比較而言，杜馬斯燃燒法精密度和穩(wěn)定性更優(yōu)于凱氏定氮法。

2.3 兩種方法的相關(guān)性分析

在對杜馬斯燃燒法與凱氏定氮法測定稻米蛋白質(zhì)含量進(jìn)行比較的基礎(chǔ)上，對兩種方法測定結(jié)果的相關(guān)性進(jìn)行分析。由圖5和圖6可見，兩種方法測定精米蛋白質(zhì)結(jié)果間均存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.9858），糙米測定值也存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.9788）。

2.4 兩種方法的檢測成本對比

檢測成本是除精密度和準(zhǔn)確度之外，評價(jià)一項(xiàng)檢測方法可行性的重要指標(biāo)。本試驗(yàn)中，兩種方法的精米和糙米蛋白質(zhì)測定次數(shù)為50×3=150，標(biāo)準(zhǔn)品測定次數(shù)為3×6=18；凱氏定氮法的硫酸銨測定次數(shù)為5，杜馬斯燃燒法的冬氨酸測定次數(shù)為5；空白測定次數(shù)為5。

杜馬斯燃燒法僅需稱樣就可上機(jī)檢測，且試劑耗材不用配制；而凱氏定氮法檢測前需要配制大量化學(xué)試劑，需要消煮樣品，且消煮過程繁瑣費(fèi)時(shí)，蒸餾滴定時(shí)使用的酸堿對實(shí)驗(yàn)人員和環(huán)境都有較大危害。由表3可看出，完成本試驗(yàn)中所有樣品的檢測，杜馬斯燃燒法僅需17.8 h，且1名實(shí)驗(yàn)員就可完成；而凱氏定氮法需39.3 h，2名實(shí)驗(yàn)員。由此可見，基于降低時(shí)間、人工成本和環(huán)保的角度來說，杜馬斯燃燒法更具有優(yōu)越性。

3 結(jié)論

杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法均能準(zhǔn)確測定出稻米蛋白質(zhì)含量，且精密度和準(zhǔn)確度都符合要求。但相較于傳統(tǒng)的凱氏定氮法，杜馬斯燃燒法在稻米蛋白質(zhì)檢測中更具優(yōu)勢。對全麥粉標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測時(shí)，杜馬斯燃燒法的RSD為0.10%，精密度高于凱氏定氮法；對糙米標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行蛋白質(zhì)檢測時(shí)，杜馬斯燃燒法的RE為0.8%，準(zhǔn)確度優(yōu)于凱氏定氮法；杜馬斯燃燒法測定精米和糙米樣品的變異系數(shù)分別為0.01%～0.80%和0.01%～1.10%，低于凱氏定氮法；兩種方法測定精米蛋白質(zhì)結(jié)果間均存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.9858），糙米測定值也存在顯著的線性相關(guān)（R2=0.9788）。在檢測成本方面，完成本試驗(yàn)中所有樣品的檢測，杜馬斯燃燒法所需時(shí)間和人力都約是凱氏定氮法的1/2，上機(jī)檢測前僅需稱樣，免去了消煮、配制試劑等諸多繁瑣程序。在環(huán)境保護(hù)方面，杜馬斯燃燒法不使用強(qiáng)酸強(qiáng)堿，少污染，對人體健康危害輕，是一種環(huán)保和高效的檢測方法。但其能否完全代替凱氏定氮法還需要進(jìn)一步研究。

表2 凱氏定氮法和杜馬斯燃燒法測定稻米蛋白質(zhì)含量

表3 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法的檢測成本比較

圖3 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定精米蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)

圖4 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定糙米蛋白質(zhì)含量的變異系數(shù)

圖5 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定稻米蛋白質(zhì)含量的相關(guān)關(guān)系

圖6 杜馬斯燃燒法和凱氏定氮法測定糙米蛋白質(zhì)含量的相關(guān)關(guān)系