組培脫毒嘉定白蒜原原種生產的技術關鍵點試驗研究

趙 碩 黃丹楓* 高 暢 楊 飛 趙穎雷 郟穎杰 郟惠彪

（1上海交通大學農業與生物學院，上海 200240；2上海蔬菜研究所，上海 201899；3上海惠和種業有限公司，上海 201899）

嘉定白蒜（Aillum sativumL.）是我國著名的大蒜品種之一，已有近百年的種植歷史，以其色澤潔白，蒜頭肥大，鱗芽6～8瓣，肉質脆嫩，辣味濃烈，貯藏性好而著稱，已被國外許多國家作為貴重藥品、滋補飲料、保健食品以及美容化妝品的制作原料。嘉定白蒜在國際市場上享有盛譽，特別是其種蒜在國際市場上一直有較強的競爭力，需求旺盛（薛友英，1999；李賢 等，2018；高暢 等，2019）。

大蒜雖然種質資源豐富，但由于其花器官不能正常進行減數分裂（彭愛芳 等，2014），無法形成可育的種子，因此在生產實踐中主要采用前一年收獲的鱗莖（蒜瓣）作為營養體繁殖播種，但鱗莖同時又是大蒜的產品器官，病毒極易通過其積累和傳播（陳世儒和黃菊輝，1991；杜永芹 等，2004；高暉和王振英，2017）。采用組織培養的方法可以有效脫除大蒜主要病毒（李賢 等，2018），還可以解決因連年種植大蒜而造成的種性退化等問題，提高繁殖系數，達到高效、增產的目的（王學利 等，2002；高暢 等，2019）。為了最終實現大蒜脫毒種苗產業化的目標，還需要對脫毒后的組培苗或組培鱗莖培育成大蒜原原種（嘉定白蒜經組培脫毒后以組培苗或組培鱗莖的形式進入田間繁育，生產上將一代稱為原原種，二代稱為原種，三代稱為生產種）的關鍵技術開展研究，分析大蒜組培脫毒后原原種繁育的影響因素以及脫毒種蒜生產的技術關鍵點。

本試驗以脫毒嘉定白蒜為試材，重點研究了水肥供給對組培苗和組培鱗莖的大蒜苗長勢及原原種質量的影響，同時研究了繼代次數和組培鱗莖播期對原原種質量的影響，然后進行了脫毒原種和常規出口蒜種的生產比較試驗，以期為實現嘉定白蒜脫毒種苗的產業化提供技術支持。

1 材料與方法

本試驗中的脫毒組培苗、鱗莖等所用品種均為嘉定白蒜，由上海惠和種業有限公司提供。

1.1 水肥供給試驗

1.1.1 試驗材料 篩選獲得相近規格的組培苗：具有3片以上綠葉，莖粗2.5～3.5 cm；篩選獲得相近規格的組培鱗莖：直徑0.5～0.8 cm。

1.1.2 試驗方法和測定項目 采用四因素兩水平完全區組試驗設計。每個處理1個穴盤，5次重復，脫毒組培苗與組培鱗莖各820株。田間處理組合與編號如表1所示。

表1 試驗處理組合與編號

試驗在上海惠和種業有限公司連棟溫室中進行。使用潮汐式肥水一體化灌溉系統進行育苗水肥的精準控制。補水頻次通過盤重控制，潮汐式灌溉液面高度3 cm，記錄灌溉日期。使用水溶肥（上海永通化工公司生產的花無缺大量元素水溶肥：總氮20%，水溶性磷20%，水溶性鉀20%）配制營養液，EC值控制在1.2～1.8 mS·cm-1，補肥時人工定量澆灌，不施肥的處理同時澆清水。

2018年4月3日將試驗材料移栽至穴盤并擺入苗床，于4月17日、5月2日、5月17日每盤隨機取5株，用直尺測定株高，以植株地上部分垂直高度為株高，在距地面2 cm處用游標卡尺測定假莖粗。6月27日精準收獲全部鱗莖，測定鱗莖的鮮質量。

1.2 繼代次數試驗

1.2.1 試驗材料 8代和15代組培鱗莖，直徑0.8～1.0 cm。

1.2.2 試驗方法和測定項目 采用完全區組試驗設計，3次重復，每次重復包括2個穴盤，共移栽組培鱗莖600株。試驗在上海惠和種業有限公司青岡基地塑料大棚中進行。分別將8代和15代組培鱗莖在4～10 ℃低溫條件下處理20 d，然后于2018年10月13日播于50孔穴盤中，將品氏泥炭、珍珠巖和蛭石按照7∶2∶1的體積比混拌成育苗基質，并在育苗基質中加入10%的有機肥。

2019年3月3日、4月2日、5月2日分別統計腋芽生長現象（次生生長）發生的比例，計算次生生長率，同時每盤隨機取5株分別統計總葉片數和綠葉數（綠葉數為總葉片數減去干枯葉片數），測定株高、假莖粗、全株以及鱗莖的干鮮質量，將樣品置于105 ℃烘箱中烘20 min，然后烘箱溫度調至80 ℃將樣品烘至恒重測定干質量。

其中，全部植株數為長成的植株數，部分穴孔的鱗莖未長成大蒜苗則未計入。

2019年5月20日精準收獲全部鱗莖，分別測定各處理鱗莖的直徑和干鮮質量，并統計全部鱗莖中正常分瓣、次生分瓣以及獨頭蒜現象的比例。

1.3 組培鱗莖播期試驗

1.3.1 試驗材料 8代組培鱗莖，直徑0.6～0.8 cm。

1.3.2 試驗方法和測定項目 采用完全區組試驗設計，3次重復，每次重復包括2個穴盤，共移栽組培鱗莖1 200株。試驗在上海惠和種業有限公司青岡基地塑料大棚中進行。組培鱗莖先在4～10 ℃低溫條件下處理20 d，然后分別于2018年9月28日、10月13日、10月28日、11月12日播于50孔穴盤中，將品氏泥炭、珍珠巖以及蛭石按照7∶2∶1的體積比混拌成育苗基質，在育苗基質中加入10%的有機肥。2019年5月20日統計次生生長發生的比例，并精準收獲全部鱗莖，分別測定各處理鱗莖的干鮮質量和直徑，并統計全部鱗莖中正常分瓣、次生分瓣以及獨頭蒜現象的比例。

1.4 原種生產的商品性比較試驗

1.4.1 試驗材料 常規大蒜種：常規用于出口的蒜種，單瓣質量≥5 g；脫毒大蒜原種：單瓣質量≥5 g；脫毒大蒜原原種：單瓣質量≥5 g。

1.4.2 試驗方法和測定項目 不同處理一次重復包含60株樣本，3次重復，共移栽540株。試驗在上海惠和種業有限公司青岡基地塑料大棚中進行。試驗地每667 m2施加有機肥1 000 kg，2018年9月26日播種。分別于2018年12月5日和2019年1月4日、2月3日、3月5日、4月4日，每個重復隨機取5株分別統計總葉片數和綠葉數、株高、假莖粗，4月5日（抽蒜薹之前）每個重復隨機取5株統計鱗莖分瓣數并測定全株和鱗莖的干鮮質量；5月20日收獲后每個重復隨機取5株統計大蒜鱗莖的分瓣數、直徑以及干鮮質量。

1.5 試驗數據處理與分析

采用SPSS 19.0軟件處理試驗數據并進行差異顯著性分析，處理間均值多重比較利用Duncan’s新復極差法，采用Excel 2016軟件進行數據整理。

2 結果與分析

2.1 水肥供給對大蒜苗生長及原原種鱗莖質量的影響

由表2和表3可見，不同組織類型培育的大蒜苗在生長上表現出顯著的差異，穴盤規格、灌溉時間以及補肥間隔也均對原原種鱗莖鮮質量有顯著影響，其中灌溉時間和補肥間隔對4月17日統計的株高也有顯著影響。由表2可見，組培鱗莖獲得原原種的鱗莖鮮質量均顯著高于組培苗，在其他因素一致的情況下，穴盤孔徑為32孔的T1、T2、T3、T4、T9、T11、T12處理獲得的原原種鱗莖鮮質量分別顯著高于50孔的T5、T6、T7、T8、T13、T15、T16處理；灌溉時間為30 min的T7、T12、T16處理獲得的原原種鱗莖鮮質量分別顯著高于灌溉時間為10 min的T5、T10、T14處理；補肥間隔為7 d的T7、T9處理獲得的原原種鱗莖鮮質量分別顯著高于補肥間隔為14 d的T8、T10處理。原原種鱗莖鮮質量較大的處理為T9、T11、T12處理，由于T12處理和T9、T11處理相比更加節肥，所以，選擇T12處理（組織類型為組培鱗莖、32孔穴盤、灌溉時間30 min、補肥間隔14 d）為最佳組合。

表2 水肥供給對兩種組織類型大蒜苗生長及原原種鱗莖質量的影響

表3 處理因素對大蒜生長指標影響的顯著值

2.2 繼代次數對大蒜苗生長及原原種鱗莖質量的影響

由表4可見，從3次統計的株高、假莖粗、總葉片數、綠葉數以及干鮮質量等生長指標來看，3月3日統計的15代組培鱗莖的全株鮮質量、鱗莖鮮質量、全株干質量和鱗莖干質量分別比8代組培鱗莖低17%、24%、27%和27%，差異顯著；而4月2日統計的指標在處理間差異不顯著；5月2日最后一次統計的15代組培鱗莖的株高、全株鮮質量及全株干質量均顯著低于8代組培鱗莖，分別低13%、13%和20%。2種繼代次數組培鱗莖的次生生長率在3次統計中差異均不顯著。

由表5可見，15代組培鱗莖獲得的原原種鱗莖中正常分瓣比例和獨頭蒜比例顯著高于8代組培鱗莖，分別高11.34、10.66個百分點；次生分瓣比例則顯著低于8代組培鱗莖，比8代組培鱗莖低22.33個百分點。

2.3 組培鱗莖播期對大蒜原原種鱗莖質量的影響

由表6可見，組培鱗莖播期對次生生長率有顯著影響，次生生長率隨著播期的延后呈下降趨勢。9月28日播種的次生生長率顯著高于其他3個播期，11月12日播種的次生生長率最低，分別比其他3個播期低22.00、11.66、5.00個百分點。不同播期也對原原種鱗莖質量產生了顯著影響，9月28日和10月13日播種得到原原種的鱗莖干鮮質量以及直徑均顯著高于后播的10月28日和11月12日2個處理，且原原種鱗莖中正常分瓣的比例顯著低于后播的2個處理，11月12日播種得到的原原種中正常分瓣的比例比9月28日高出5.50個百分點，次生分瓣比例則比9月28日低11.98個百分點。

2.4 脫毒原種生產的商品性比較試驗

由表7可見，在5次田間統計中，脫毒大蒜原種和原原種的株高、假莖粗、總葉片數和綠葉數均顯著高于常規大蒜種。由表8可見，抽薹前（4月5日）統計的脫毒大蒜原種和原原種的全株干鮮質量、鱗莖的干鮮質量、分瓣數也顯著高于常規大蒜種，以脫毒大蒜原原種為例，其全株鮮質量、鱗莖鮮質量、全株干質量、鱗莖干質量、分瓣數分別比常規大蒜種高出49%、38%、85%、38%、127%。

由表9可見，5月20日收獲時統計的脫毒大蒜原種和脫毒大蒜原原種的鱗莖干鮮質量以及直徑均顯著高于常規大蒜種，以脫毒大蒜原原種為例，其獲得的鱗莖的鮮質量、干質量以及直徑分別比常規大蒜種高出86%、124%和30%，而脫毒大蒜原種最終得到鱗莖的分瓣數顯著低于常規大蒜種。

表4 繼代次數對大蒜苗生長的影響

表5 繼代次數對大蒜原原種鱗莖質量的影響

表6 不同播期對大蒜苗次生生長及原原種鱗莖質量的影響

表7 不同蒜種類型對大蒜苗生長的影響

表8 不同蒜種類型對抽薹前大蒜苗生長和鱗莖質量的影響

表9 不同蒜種類型對收獲鱗莖質量的影響

3 討論與結論

大蒜生產受水分、肥料的影響較大（王飛 等，2017），穴盤規格、灌溉時間和補肥間隔都影響著大蒜生長的水肥供給狀況。本試驗發現32孔穴盤比50孔穴盤更有利于原原種鱗莖鮮質量的提高。在工廠化育苗過程中，穴盤的選擇應從生產管理、經濟效益、作物特性和生長發育等方面加以綜合考慮（Styer &Koranski，1997），從本試驗結果來看，2種組織類型中最終獲得原原種鱗莖鮮質量最大的處理均出現在32孔穴盤，鱗莖的質量相對大更符合生產的要求，因此，在大蒜原原種繁育過程中可以選擇孔徑相對大的穴盤。本試驗結果表明，較短的補肥間隔和較長的灌溉時間有利于原原種鱗莖質量的提高。有研究表明適當提高追肥頻率可以使施肥量在作物生長期內分布更加均勻，持續為作物提供營養（陳高聽，2016），而潮汐灌溉過程中較長的灌溉時間能夠促進幼苗的生長（高艷明 等，2016）。

繼代培養是植物組織培養過程中的重要環節，也是離體保存種質資源的必要手段（齊靜靜 等，2014）。前人研究認為，影響植物離體快繁的因素除了培養條件、外植體類型外，繼代次數也是一個重要因素（Duncan，1996）。本試驗發現，15代組培大蒜鱗莖在3月3日和5月2日測定的部分生長指標（全株鮮質量、全株干質量）要顯著低于8代組培鱗莖，這和前人的研究結果類似。李招文等（1989）研究發現黃蝦花試管苗在第1、2代生長正常，而第3代后試管苗生長矮小、細弱、分化率逐步下降；齊靜靜等（2014）研究發現，第3代除蟲菊組培苗總體植株生長健壯，而第5代組培苗則表現出了枝葉纖細和生長緩慢現象。在本試驗中，15代組培鱗莖獲得原原種的正常分瓣比例顯著高于8代組培鱗莖，而次生分瓣的比例則顯著低于8代組培鱗莖。次生分瓣主要是由于大蒜的次生生長造成的，這可能是由于8代組培鱗莖長勢旺盛，伴隨著次生生長現象的多發從而導致了鱗莖次生分瓣比例增加。通過綜合比較，15代組培鱗莖盡管長勢弱于8代組培鱗莖，但是次生分瓣比例低，且獲得的原原種鱗莖干鮮質量和8代組培鱗莖差異不顯著，所以在脫毒嘉定白蒜原原種繁育中推薦使用15代組培鱗莖。

本試驗發現不同播期對大蒜的次生生長率產生了顯著影響。次生生長是大蒜的生理畸形現象，會導致大蒜鱗莖的次生分瓣，在我國南、北各地均有不同程度的發生（陸幗一 等，1992）。大蒜次生生長發生的影響因素可歸結為環境因子、栽培措施及遺傳特性3個方面（陳廣平，2008）。本試驗發現次生生長率隨著播期的延后呈下降趨勢，且相對晚播（10月28日和11月12日）得到的原原種鱗莖中正常分瓣比例也要顯著高于相對早播（9月28日和10月13日）的處理。程智慧和陸幗一（1991）在對蒼山蒜的研究中也發現早播造成了次生生長的增加，但是有利于大蒜的初級生長和產量的提高。本試驗發現相對早播的2個處理得到的原原種鱗莖的干鮮質量及直徑都要顯著高于相對晚播的2個處理。已有研究指出，大蒜早播，冬前積溫高，大蒜生育進程加快，植株個體大，為花鱗芽的提早分化創造了物質條件，一定程度上有利于后期產量提高，但是同時也為大蒜發生次生生長創造了條件（嚴根元 等，1990）。因此推薦將嘉定白蒜的播期定于每年10月中下旬，此時播種有助于獲得較高的產量，且可以減少大蒜次生生長現象的發生，從而提高收獲大蒜中正常分瓣的比率。

國際市場對大蒜鱗莖有外形完整、皮色潔白、無霉變、無蟲蛀以及含水量低等標準，這就對大蒜的鱗莖生產提出了更高的質量要求（陳廣平，2008）。本試驗發現脫毒大蒜原種和原原種在生長期的各項生長指標以及收獲得到的鱗莖質量均顯著好于常規大蒜種，這和前人的研究結果一致。周緒元等（2003）研究發現脫毒的3個蒼山大蒜品種的蒜頭產量均比未脫毒對照顯著增產，且脫毒大蒜蒜頭的經濟性狀表現優于對照。徐培文（1998）也發現脫毒蒜生長繁茂，蒜頭平均增產32%～78%。

本試驗結果表明，水肥供給、繼代次數以及播期均對嘉定白蒜原原種的鱗莖質量有顯著影響。通過水肥供給試驗篩選出了最佳處理組合：組織類型為組培鱗莖、32孔穴盤、灌溉時間30 min、補肥間隔14 d；繼代次數試驗表明，15代組培鱗莖相比8代組培鱗莖更適合用于嘉定白蒜原原種繁育；將嘉定白蒜的播期定于每年10月中下旬更有利于獲得較高的收益。通過生產比較試驗，脫毒大蒜種相比常規大蒜種在生產上均表現出突出的優勢。