復發性早期妊娠丟失與葉酸代謝相關基因多態性關系的研究

崔 雙，唐禹馨，侯海靜

(1.舟山醫院婦產科，浙江 舟山 316000；2.舟山婦幼保健院產科，浙江 舟山 316000)

妊娠丟失(pregnancy loss，PL)可出現在整個妊娠期間，其中胚胎開始發育的妊娠早期較為常見。早期妊娠丟失(early pregnancy loss，EPL)是指妊娠12周以前的妊娠丟失，包括流產和生化妊娠丟失[1]。結合我國相關研究，EPL在妊娠丟失中約占80%，最常見的有自發性流產，胚胎停育，胎死宮內等情況[2]。復發性EPL由于其病因復雜、預后較差和對孕婦身心健康的不良影響，一直受到學界關注。葉酸(即維生素B9)是一種水溶性的維生素，對促進胎兒神經細胞分化、預防胎兒的神經管畸形有重要作用。然而葉酸需要進行多重酶的催化作用才能產生活性，其中亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)、甲硫氨酸合成還原酶(MTRR)等屬于關鍵酶，其基因位點的多態性易造成酶活性降低而導致葉酸代謝障礙，引發相關疾病[3]。有研究指出，部分婦女產生不良孕產結局與葉酸代謝相關酶基因多態性有關[4]。葉酸多聚谷氨酸是人體通過飲食而攝取的葉酸，需要在空腸中水解為葉酸單聚谷氨酸才能進入血液。我國地域遼闊，南北飲食差異巨大，而且機體對于葉酸的吸收代謝能力因人而異，所以人體葉酸代謝基因多態性也具有較大差異[5]。目前對于葉酸代謝相關基因多態性與不良妊娠結局的研究較多，但鮮見對復發性EPL的專門研究。本文旨在研究復發性EPL與葉酸代謝相關基因多態性的關系，為我國妊娠婦女的相關臨床研究提供依據。

1資料與方法

1.1一般資料

選取2016年4月至2018年4月在舟山醫院和舟山婦幼保健院婦產科就診的170例孕婦為研究對象。納入標準：①年齡為20～35周歲，民族不限；②臨床診斷為復發性EPL，指妊娠婦女在孕12周之前出現2次及以上的流產[6]；③了解研究內容并自愿簽署知情同意書。排除標準：①有吸煙史、酗酒史；②患有腫瘤者或者其他嚴重的循環、血液等系統疾病；③合并子宮畸形、宮頸功能不全、染色體異常、妊娠期并發癥或已知胎兒畸形。符合入組標準的復發性EPL孕婦84例為研究組，選取正常分娩或者是妊娠結局正常的孕婦86例為對照組，兩組的年齡、身體質量指數(BMI)、民族、孕次、產次比較差異均無統計學意義(均P>0.05)，見表1。

表1 兩組人口學及病情資料比較結果

1.2研究方法

1.2.1收集研究對象信息

成立復發性EPL與葉酸代謝相關基因多態性研究的團隊，團隊成員進行統一的培訓，培訓合格后方可開展本項研究。培訓的主要內容包括：妊娠婦女肘靜脈血采樣方法，數據的采集、錄入、統計學方法。收集信息內容包括：①研究對象的一般情況資料，如年齡、BMI、民族等；②妊娠婦女孕期情況、孕產史、家族史等。

1.2.2采集DNA的方法

由專業團隊成員采樣妊娠婦女肘晨間空腹靜脈血4mL，利用PCR-熒光探針試劑盒抽提研究對象樣本的DNA。

1.2.3檢測方法

運用PCR和熒光法進行亞甲基四氫葉酸還原酶(MTHFR)基因的C677T、A1298C位點、甲硫氨酸合成還原酶(MTRR)基因的A66G位點的SNP分型。Taqman-MGB探針所在的位置見表2。PCR每個反應體系為10μL總體積，包含20ng/μL×1μL的DNA模板、5μL的2×Taqman Universal Master Mix，0.5μL的20×Taqman-MGB探針和3.5μL去離子水。PCR反應條件為95℃ 10min，第一步在92℃ 15s、60℃ 1min條件下進行20個循環的擴增，第二步在89℃ 15s，60℃ 90s條件下進行30個循環的擴增。反應結束后，在ABI熒光PCR儀器(ABI 7900型，美國應用生物系統公司生產)上讀取樣品孔中的終點熒光，利用配套的分析軟件計算各個樣本的基因分型結果。

表2 Taqman-MGB探針位置

1.3統計學方法

2結果

2.1兩組MTHFR基因的C677T比較

兩組MTHFR基因C677T中CC型、CT型和TT型分布比較差異有統計學意義(χ2=7.212，P=0.027)，見表3。

表3 兩組MTHFR基因C677T分布的比較結果[n(%)]

2.2兩組MTHFR基因的A1298C比較

兩組MTHFR基因A1298C中AA型、AC型、CC型分布比較差異有統計學意義(χ2=6.458，P=0.038)，見表4。

表4 兩組MTHFR基因A1298C比較結果[n(%)]

2.3兩組MTRR基因的A66G比較

兩組MTRR基因A66G中AA型、AG型、CG型分布比較差異有統計學意義(χ2=7.093，P=0.029)，見表5。

表5 研究組與對照組MTRR基因A66G比較結果[n(%)]

3討論

3.1復發性妊娠丟失的流行病學研究

復發性妊娠丟失是指孕婦發生自發性流產、胚胎的停育、胎死宮內的情況連續發生兩次或者兩次以上[6]。引起妊娠婦女復發性EPL的原因與多種因素有關，主要包括：染色體異常、遺傳相關因素、妊娠婦女內分泌及免疫功能紊亂等。妊娠丟失后再次妊娠的成功率僅為37%，胎死宮內的發生率為32%，婦女出現自然流產的發生率也達到28%[7]。相關流行病學研究顯示，妊娠丟失的患者中37%～44%具有較為明確的原因，大部分妊娠丟失的原因尚無法解釋[8]。復發性EPL是早期妊娠不良結局中最為常見的一種，并且引發其產生的原因較多、較為復雜，如：染色體的異常、妊娠婦女合并有全身性的疾病、感染因素、內分泌因素、妊娠早期接受腹部手術、胎兒附屬物(胎盤、臍帶)等因素[9]。我國復發性EPL的發生率呈上升的趨勢，值得醫護人員的關注。

3.2葉酸代謝相關基因多態性的作用

葉酸是妊娠婦女體內極其重要、不能缺少的營養物質，其具有極其重要的生理作用，包括DNA的合成、甲基化、人體生長發育、基因表達等多個方面。同時葉酸對胎兒中樞神經系統發育有重要作用，相關代謝基因與妊娠婦女子癇前期、胎盤早剝及復發性流產等不良妊娠結局具有高度相關性[10]。妊娠婦女對葉酸的需求是普通人對葉酸需求的4倍，人體內眾多酶系與葉酸的轉運、代謝有關，而其中葉酸代謝的關鍵酶是MTHFR和MTRR兩種。關鍵酶的基因在不同的國家、地區的人群中具有多態性[11]。當其發生突變時，會使酶的活性發生相應的改變，從而導致葉酸的代謝發生改變，并導致活性葉酸在妊娠婦女的體內水平異常。妊娠婦女MTHFR基因最為重要，在人體染色體上可以編碼氨基酸的數量為656個，位置是1p36.3，一共包括了外顯子11個，內含子10個。MTHFR基因編碼的蛋白質可以對5,10-亞甲基四氫葉酸為5-甲基四氫葉酸進行轉化。近年的研究發現，MTHFR基因發生的多態性突變位點已經達到了近20種，其中最為重要的突變位點是C677T位點及A1298C這兩個位點[12]。C677T多態性突變后，表現的基因型有3種，分別為：CC型、CT型及TT型。A1298C多態性突變后，表現的基因型有3種，分別為：AA型、AC型及CC型。MTRR基因的A66G多態性突變后，表現的基因型有3種，分別為：AA型、AG型和GG型[13]。

3.3復發性EPL與葉酸代謝相關基因多態性的關聯

本研究結果表明研究組MTHFR基因C677T位點的CC型、CT型和TT型基因分布，A1298C位點的AA型、AC型、CC型基因分布和MTRR基因A66G位點的AA型、AG型、CG型基因分布均高于對照組，這與國內的相關研究結果相似[14-15]，其中研究組的TT型、CC型和CG型分布均高于既往報道，提示該3種基因型的表達可能與妊娠丟失反復發作有一定關聯，但這需要未來進一步研究證實。

綜上所述，復發性EPL與葉酸代謝相關基因多態性具有相關性，對于有高危基因型突變的妊娠婦女應盡早、及時地進行干預，減少復發性EPL的發生。