黃芪多糖預處理對腎缺血再灌注損傷大鼠細胞凋亡的影響

南陽市第二人民醫院腎病風濕科，河南 南陽 473000

腎缺血再灌注損傷(Renal Ischemical Reperfusion Injury，RIRI)是指在腎缺血的基礎上，當恢復血流灌注后，損傷不僅沒有改善，反而加重的現象[1]。RIRI發病機制復雜，其中繼發性的細胞凋亡可能起到重要作用[2]，通過抑制細胞凋亡來作為治療的靶點，為研究開發新型藥物開辟了新的途徑。從中醫學的角度來看，細胞凋亡與中醫正氣學說有密切聯系[3]。RIRI根據其臨床表現可將其歸于“關格”“虛勞”“溺毒”“癃閉”等范疇，其病因病機皆與脾腎有關，脾腎兩虛易致濁毒內蘊、邪氣增多[4]。《素問·通評虛實論》曰：“邪氣盛則實，精氣奪則虛”。

黃芪為豆科類植物膜莢黃芪或者蒙古黃芪干燥后的根，其味甘、性微溫，歸脾肺經。《本草匯言》贊其為“補肺健脾，實衛斂汗，驅風運毒之藥也”。國內外研究表明其具有保護腎臟，對腎臟疾病具有治療作用[5]。黃芪多糖(Astragalus Polysac charides，APS)為黃芪的有效成分之一，在心肌[6]、腦[7]的缺血再灌注損傷中具有抗細胞凋亡的作用。腎臟作為缺血再灌注損傷的常見器官之一，APS是否通過抗細胞凋亡，發揮對RIRI的保護作用，還未見相關報道。實驗擬通過在大鼠體內復制RIRI模型，從抗細胞凋亡角度分析APS對RIRI作用的機制，以期為臨床APS的運用提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗動物 健康雄性成年S-D大鼠30只，體重200～300 g左右，購于山西醫科大學實驗動物中心，編號：SXYK180605120。分組飼養，室溫控制在20～25 ℃，空氣濕度控制在50%～55%，飲食與飲水均標準化供給。

1.1.2 實驗藥品和試劑 APS(批號：1803152230，上海康舟真菌多糖公司)；TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒(批號：18I03AJ，武漢博士德生物工程有限公司)；肌酐(Cr)試劑盒、尿素氮(BUN)試劑盒均購自于南京建成生物工程研究所，批號皆為201809036；Bax(Bcl-2 associated X蛋白質，批號：2343179)、Bcl-2(B淋巴細胞瘤-2基因，批號：185641)免疫組化試劑盒購自于武漢博士德生物工程有限公司。

1.1.3 儀器 7020型全自動生化分析儀(日本HITAHI公司)；TS-12U型生物組織自動脫水機(孝感市宏業醫用儀器有限公司)；TDK-BMB型石蠟冰凍切片機(浙江金華市益迪醫療設備廠)；顯微鏡(日本尼康公司)；DMR+Q550型病理圖像分析儀(德國Leica公司)。

1.2 方法

1.2.1 建模和分組 30只大鼠隨機分為3組：模型組、假手術組和APS干預組，每組10只。手術前12 h禁食不禁水，各組動物以45 mL/kg劑量戊巴比妥鈉腹腔注射進行全身麻醉。仰臥位固定，沿腹正中切開腹部，模型組大鼠游離雙側腎臟并分離腎動脈，用無創動脈夾夾閉雙側腎動脈60 min，然后松開動脈夾，腎臟由紫黑色變為鮮紅，表明模型制備成功，如果松開動脈夾5 min后，腎臟顏色沒有變為鮮紅色，說明模型制作失敗，這種大鼠被剔除。假手術組只沿腹正中切開腹部，并分離左右腎臟，不夾閉腎動脈。APS干預組在模型制作前給予450 mg/kg APS灌胃，連續用藥10 d，1次/d，假手術組與模型組給予等量的生理鹽水灌胃。各組大鼠手術后單籠常規飼養，48 h后腎動脈采血，然后處死大鼠并摘取腎臟組織。

1.2.2 血清BUN、Cr含量測定 將采集的血液，以3 000 r/min離心15 min后提取血清。參照說明書通過全自動生化分析儀測定血清中的BUN、Cr含量。

1.2.3 TUNEL法檢測腎臟細胞凋亡 取腎組織固定，常規石蠟包埋、切片，嚴格參照細胞凋亡檢測試劑盒說明書對腎臟凋亡細胞進行檢測。光鏡下凋亡細胞核染色為棕黃色。在顯微鏡(×400)下，每張切片隨機選擇5個非重疊視野進行觀察，計數凋亡細胞數目，取平均值，計算細胞凋亡指數，具體公式為：細胞凋亡指數=(凋亡細胞數/總細胞數)×100%

1.2.4 免疫組化檢測腎組織Bax和Bcl-2蛋白表達 制備腎組織切片，用SABC免疫組化染色法檢測Bax、Bcl-2的表達，操作步驟嚴格參照試劑盒說明書。Bax和Bcl-2表達陽性結果為胞漿染色呈棕色，不著色者為陰性。在顯微鏡(×400)下，每張切片隨機選擇5個非重疊視野進行觀察，計算陽性反應區域面積的平均光密度值(OD)。

2 結果

2.1 各組大鼠血清BUN、Cr水平比較 與假手術組比較，模型組大鼠血清BUN和Cr含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，APS干預組大鼠血清BUN和Cr含量明顯下降(P<0.01)。具體結果見表1。

表1 各組大鼠血清BUN和Cr水平比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.2 各組大鼠細胞凋亡指數比較 與假手術組比較，模型組腎臟細胞凋亡指數明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，APS干預組大鼠腎臟細胞凋亡指數明顯降低(P<0.01)。具體結果見表2、圖1。

表2 各組大鼠腎組織細胞凋亡指數比較

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

2.3 各組大鼠腎組織Bax和Bcl-2蛋白表達 與假手術組比較，模型組腎臟Bax表達明顯升高，Bcl-2表達明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，APS干預組大鼠腎臟Bax表達明顯降低，Bcl-2表達明顯升高(P<0.01)。具體結果見表3、圖2。

組別BaxBcl-2假手術組0.38±0.060.95±0.15模型組0.85±0.13?0.46±0.06?APS干預組0.56±0.85#0.76±0.11#

注：與假手術組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05。

3 討論

RIRI是因腎供血障礙后血流再灌注而導致的常見的應激性疾病，臨床最常見于腎移植術后[8]。RIRI導致腎臟血管損傷，引發腎小管代謝紊亂甚至壞死，進而影響腎血流，最終導致腎細胞凋亡、壞死，直至腎功能衰竭。通過本實驗研究發現與假手術組比較，模型組大鼠血清BUN和Cr含量明顯升高(P<0.01)；與模型組比較，APS干預組大鼠血清BUN和Cr含量明顯下降(P<0.01)。提示RIRI大鼠腎功能下降，通過APS干預作用后腎功能得到改善，說明APS對RIRI大鼠腎臟具有保護作用。

細胞凋亡是指細胞在一定生理或病理條件下，通過啟動內部自身機制，激活內源性核酸內切酶而引起自身細胞死亡的現象[9]，其在RIRI病理生理中發揮重要作用[10]。細胞凋亡與多種基因表達有關，其中Bcl-2家族為現在研究較為深入的調控基因之一。迄今已發現Bcl-2家族包括20多種成員，按其功能可分為抑制凋亡的亞家族(包括Bcl-2、Bcl-xL、Bcl-w、mcl-1、A1/Bfl-1等)和促進凋亡的Bax亞家族(包括Bax、Bcl-XS、Bad、Bik、Bak、Bid、Hrk等)，其中Bcl-2和Bax是最主要的成員。Bcl-2具有抗細胞凋亡作用，而Bax具有促進細胞凋亡的作用，在正常情況下Bcl-2與Bax調控作用保持動態平衡，當Bcl-2表達程度升高或者Bax的表達程度受到抑制時，就會抑制細胞凋亡[11]，這種抑制的機理包括以下幾種可能：①對促細胞凋亡基因信號傳達產生阻隔作用，或使得相關基因失效[12]；②Ca2+內流在細胞中發生變化，使凋亡受到抑制；③抑制氧自由基的產生，減少氧化應激等。而Bax表達的增強，使線粒體通透性增大，進而使細胞內引入大量的細胞色素C，促進細胞凋亡[12]。通過本研究顯示，與假手術組比較，模型組大鼠腎臟細胞凋亡指數明顯升高，且Bax表達明顯升高、Bcl-2表達明顯下降(P<0.01)；與模型組比較，APS干預組大鼠腎臟細胞凋亡指數明顯降低，且Bax表達明顯降低、Bcl-2表達明顯升高(P<0.01)。說明APS通過對凋亡基因進行調節的作用，抑制細胞凋亡，保護腎臟，避免產生腎損傷。

黃芪作為傳統名貴中藥，有補氣升陽、固表止汗、行水消腫和托毒生肌的功效，有“補氣諸藥之最”之稱。APS作為黃芪中最重要的一種藥用物質，大量實驗證明其具有抗細胞凋亡的作用。綜上所述，APS預處理具有減輕腎臟細胞凋亡，改善RIRI腎功能的作用，其機制可能與Bax蛋白表達下調，以及Bcl-2蛋白表達上調有關。