石油污染脅迫下冰草根圍叢枝菌根真菌侵染率研究

楊 燕, 山寶琴

(延安大學(xué) 石油工程與環(huán)境工程學(xué)院，陜西 延安 716000)

前言

陜北地區(qū)石油儲(chǔ)量豐富，在長期的生產(chǎn)過程中石油直接或間接進(jìn)入土壤，影響土壤的通透性、破壞土壤結(jié)構(gòu)、引起土壤理化性質(zhì)及土壤中微生物的活性最終通過食物鏈的傳遞影響人類健康[1]。因此修復(fù)陜北石油污染土壤已成為一項(xiàng)迫在眉睫的工作。

石油污染土壤的微生物修復(fù)技術(shù)是當(dāng)今環(huán)保領(lǐng)域中的新熱點(diǎn)[2～4]。植物與叢枝菌根真菌共生修復(fù)是利用兩者間的共生結(jié)構(gòu)來增強(qiáng)對(duì)根際土壤有機(jī)污染物的降解。叢枝菌根(Arbuscular mycorrhiza，AM)真菌是一類廣泛存在于土壤中的微生物，能與80%的高等植物形成共生體，從而有效改善植物對(duì)多種營養(yǎng)元素的吸收作用，強(qiáng)化植物對(duì)污染物的降解[5]。AM真菌能在植物根圍土壤中形成龐大的菌絲網(wǎng)，提高土壤中多種酶的活性，促進(jìn)許多有益菌的生長，從而降低有機(jī)污染物的活性，并減少毒害，進(jìn)一步增強(qiáng)植物的抗逆性[6]。AM真菌能夠使污染物轉(zhuǎn)換成植物易吸收態(tài)，從而提高植物對(duì)污染物的降解[7]。它與宿主植物之間形成的根圍共生系統(tǒng)，能夠幫助植物降解污染物，進(jìn)而達(dá)到共生修復(fù)的目的。

目前石油污染條件下AM真菌修復(fù)技術(shù)的相關(guān)研究[8,9]方興未艾，野外條件下AM真菌與植物的共生修復(fù)是主攻方向[10]，國內(nèi)針對(duì)生物修復(fù)材料的篩選也極為廣泛。但是野外條件下石油污染土壤中，冰草根圍叢枝菌根侵染率和共生形態(tài)的研究尚未見報(bào)道，值得探索。

冰草(Agropyron cristatum)，別名：多花冰草、光穗冰草，屬于禾本科冰草屬。在陜北生長良好，尤其在石油污染的井場周圍長勢(shì)明顯好于其它植物，其強(qiáng)大的生物量、發(fā)達(dá)的根系、頑強(qiáng)的抗逆性及快速生長等特點(diǎn)，具有作為陜北石油污染土壤植物修復(fù)材料的巨大優(yōu)勢(shì)與潛力。

本研究著重研究野外條件下，不同石油烴污染濃度的土壤中冰草根圍叢枝菌根真菌的侵染率及真菌多樣性分析，以期為今后利用冰草-AM真菌共生技術(shù)修復(fù)陜北地區(qū)石油污染土壤提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣地概況

試驗(yàn)樣地選在延長石油(集團(tuán))下屬的甘谷驛采油廠(N36°42'1.38″，E109°50'23.52″)周邊輕度污染土壤，土質(zhì)為黃綿土，半干旱大陸性季風(fēng)氣候，四季冷暖干濕分明，年平均氣溫10.4℃，年平均降水量563.6 mm。

1.2 樣品的采集及預(yù)處理

試驗(yàn)始于2018年3月，為期3個(gè)月，根據(jù)前期調(diào)研，陜北石油污染土壤的總石油烴含量通常在150～20 000 mg·kg[11]，因此將原輕度污染土壤調(diào)整成4種石油烴濃度5 000、10 000、15 000 和20 000 mg·kg[11]，并就近選擇無污染土壤作為對(duì)照(CK)，各設(shè)5個(gè)平行，共25個(gè)樣地。

將上年秋季采集并冷藏于冰箱的冰草種子，按照株行距20 cm×50 cm每種設(shè)置10粒播種于樣地，使其濕度保持在30%～50%，自然條件下生長，待冰草長出后間苗至3棵。3個(gè)月后，將冰草整株挖出采集根系裝入信封，同時(shí)用土壤采樣器采集冰草根圍0～20 cm深的土壤，裝入密封袋帶回實(shí)驗(yàn)室。根系洗凈待用，土壤自然風(fēng)干，研磨并過2 mm篩待用。

1.3 主要測定方法

1.3.1 土壤理化性質(zhì)的測定 土壤有機(jī)質(zhì)采用重鉻酸鉀法測定；土壤堿解氮用堿解擴(kuò)散法測定；土壤速效磷用NaHCO3浸提-鉬銻抗比色法測定；土壤pH用浸提液電位法測定。供試土壤理化性質(zhì)見表1。

表1 不同石油烴濃度下土壤理化性質(zhì)

1.3.2 AM真菌菌根侵染率的測定 每種設(shè)置挑取長約1 cm，直徑0.05～0.08 mm的冰草細(xì)根根段20條，洗凈用10%的KOH溶液浸泡，95℃水浴加熱1.5h，倒去KOH并清洗至不再呈黃色，加1%鹽酸酸化3 min后倒去，再用酸性品紅溶液染色，最后制成裝片置于Olympus BXSO 顯微鏡下觀測根系A(chǔ)M真菌菌絲和泡囊的侵染狀況[13]，菌絲侵染率計(jì)算公式見式(1)，泡囊侵染率計(jì)算公式見式(2)。

菌絲侵染率=(菌絲侵染根段數(shù)/被檢根段總數(shù))×100%

(1)

泡囊侵染率=(泡囊侵染根段數(shù)/被檢根段總數(shù))×100%

(2)

1.3.3 AM真菌孢子密度的測定 用濕篩傾注蔗糖離心法[12]對(duì)10g風(fēng)干土樣中的AM真菌孢子進(jìn)行分離，在體視鏡下挑取AM真菌孢子并對(duì)孢子進(jìn)行計(jì)數(shù)。AM真菌孢子密度為1 g風(fēng)干土樣中含有的AM真菌孢子數(shù)，相對(duì)多度計(jì)算公式見式(3)，頻度計(jì)算公式見式(4)。

相對(duì)多度=某1個(gè)種的孢子數(shù)/總的孢子數(shù)×100%

(3)

頻度=某1個(gè)種出現(xiàn)的樣品數(shù)/總樣品數(shù)×100%

(4)

1.4 數(shù)據(jù)處理

用Excel對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行處理并制圖；用SPSS軟件進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)和相關(guān)性(Pearson)分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 不同石油烴污染濃度下冰草根圍AM真菌侵染率與土壤中孢子密度

在野外修復(fù)條件下，設(shè)定石油烴濃度為唯一差異因子，不同石油烴濃度下菌絲、泡囊侵染率和AM真菌孢子密度見圖1。

由圖1 (a)可知，AM真菌和冰草有良好的共生性，即使在沒有污染的條件下，菌絲的侵染率也高達(dá)90%以上；在石油烴濃度為5 000～20 000 mg·kg-1時(shí)，冰草根圍菌絲侵染率為89%～99%，隨污染濃度的增加先減后增且差異性顯著，在10 000 mg·kg-1時(shí)最小，輕度污染時(shí)，菌絲侵染率下降，這可能是因?yàn)樯倭康氖蜔N可以充當(dāng)植物的碳源[14]，對(duì)冰草的生長有一定的促進(jìn)作用，因?yàn)樗拗髦参锱cAM真菌之間是一種偏利共生[15]，宿主植物生長越好，其對(duì)根圍AM真菌的依賴性就越小。當(dāng)受到高濃度石油烴污染時(shí)，土壤易粘結(jié)成塊，水分凝結(jié)成珠難以入滲，AM真菌能促進(jìn)植物對(duì)土壤中水、氮和磷等營養(yǎng)物質(zhì)的吸收，從而促進(jìn)植物在逆境中生長。

由圖1 (b)可知，冰草根圍泡囊的侵染率為42%～59%，平均值為51%，隨石油烴濃度的增加總體呈增大趨勢(shì)，但無顯著差異。真菌與光合生物共生形成泡囊[16]，一般認(rèn)為它是儲(chǔ)存營養(yǎng)的主要真菌結(jié)構(gòu)。

由圖1 (c)可知，冰草根圍土壤中AM真菌孢子密度隨石油烴濃度的增加顯著減小，當(dāng)石油烴濃度為20 000 mg·kg-1時(shí)，AM真菌孢子密度達(dá)到最小值22.8個(gè)·g-1·土。這與耿春女等[17]的研究結(jié)論一致，油場周圍原油污染土壤中AM真菌孢子密度隨原油濃度增加而減少。原油對(duì)真菌的活性抑制首先可能是因?yàn)槭蜔N的組分中芳香烴等有害物質(zhì)結(jié)構(gòu)復(fù)雜，水溶性差，進(jìn)入土壤后難以降解，會(huì)堵塞土壤孔隙，降低土壤通透性[18]，而AM真菌屬于好氧菌，土壤含氧量降低必然會(huì)抑制AM真菌的生物活性。其次可能是隨著石油烴濃度的增加，土壤的pH值隨之增加，而酸性土壤更適合真菌生長[19]，因此AM真菌孢子密度隨石油烴濃度的增加而減少。

圖1 不同石油烴濃度下叢枝菌根侵染特性

2.2 土壤中AM真菌多樣性

石油污染土壤中冰草根圍AM真菌多樣性見表2，在所有供試土壤中分離并鑒定出AM真菌孢子共9種，其中球囊霉屬(Glomus)8種，無梗囊霉屬(Acaulospora)1種。優(yōu)勢(shì)種為近明球囊霉(G.clarideum)，頻度為92.4%，相對(duì)多度為51.6%；常見種為網(wǎng)狀球囊霉(G.reticulatum)和地球囊霉(G.geosporum)，頻度分別為57.6%和48.1%，相對(duì)多度分別為8.0%和10.7%；偶見種為摩西球囊霉 (G.mosseae)，頻度為7.9%，相對(duì)多度為3.3%。

表2 冰草根圍AM真菌多樣性

2.3 冰草根圍AM真菌孢子形態(tài)

圖2 AM真菌孢子形態(tài)

2.4 真菌侵染率與土壤理化因子的相關(guān)性

AM真菌侵染率與土壤理化因子相關(guān)性分析見表3，泡囊侵染率和石油烴濃度、土壤有機(jī)質(zhì)都顯著正相關(guān)，方燕等[20]研究也證明土壤有機(jī)質(zhì)與菌根侵染率呈正相關(guān)，土壤理化性質(zhì)是影響侵染率的重要因素之一[21]；孢子密度和土壤堿解氮顯著負(fù)相關(guān)，和石油烴濃度、土壤有機(jī)質(zhì)、pH都呈極顯著負(fù)相關(guān)。在一定條件下土壤速效養(yǎng)分含量低，pH中性偏酸，透氣性良好，則有利于AM真菌產(chǎn)孢，反之則抑制孢子發(fā)育[16]。

表3 AM真菌侵染率與土壤理化因子相關(guān)性分析

注：*表示p< 0.05 水平上顯著相關(guān)；**表示p< 0.01 水平上顯著相關(guān)。

3 結(jié)論

(1)冰草根圍AM真菌菌絲侵染率隨石油烴濃度的增加先減后增，說明石油烴污染濃度增加明顯協(xié)迫宿主植物生長，從而增強(qiáng)其對(duì)真菌的依賴度；土壤中AM真菌孢子密度隨石油烴濃度的增加顯著減小，其活性受到高濃度石油烴的毒害抑制。

(2)冰草根圍石油污染土壤中分離并鑒定出AM真菌孢子共9種，其中球囊霉屬8種，占88.9%，優(yōu)勢(shì)種為近明球囊霉，頻度為92.4%，相對(duì)多度為51.6%。推薦冰草-近明球囊霉(G.clarideum)組合可做為石油污染土壤的生物修復(fù)材料進(jìn)一步研究。

(3)AM真菌泡囊侵染率和石油烴濃度、土壤有機(jī)質(zhì)顯著正相關(guān)，孢子密度和土壤堿解氮、石油烴濃度、土壤有機(jī)質(zhì)、pH均呈負(fù)相關(guān)，說明冰草與根圍AM真菌間的共生關(guān)系受到土壤理化性質(zhì)的顯著影響。