Box-Behnken響應面優化酒黃精多糖的超聲提取工藝及其抗氧化活性研究

蔡興航,謝 培，史鑫波，侯 青，黃文靜

(1.陜西中醫藥大學 陜西省中藥資源產業化協同創新中心，陜西 咸陽 712046；2.陜西中醫藥大學，陜西 咸陽 712000)

黃精是作為大宗藥食同源植物之一，化學成分主要包括多糖、甾體皂苷、生物堿、木脂素、黃酮等，其中多糖和甾體皂苷類成分在黃精中含量較大，為其主要藥效成分[1-6]。黃精多糖具有調節免疫力、改善記憶功能、抗抑郁、降血糖、調血脂和抗動脈粥樣硬化等作用[7-13]。黃精經酒制后，不僅可以消除刺激性，而且能增強補益療效[14]，經推斷或與酒黃精中新的化合物有關[15]。目前，鮮有酒黃精多糖抗氧化研究報道，所以本研究擬酒黃精為研究對象，通過超聲波法對酒黃精多糖進行提取，并用Box-Behnken響應面法進行工藝條件優化，通過評價酒黃精多糖對DPPH自由基清除率，以及對SW620細胞抗氧化活性的影響，探尋酒黃精多糖的抗氧化作用，為酒黃精多糖的深層次開發提供有效的技術支持。

1 材料

實驗所用材料購于陜西興盛德藥業有限責任公司。由陜西中醫藥大學劉世軍副教授鑒定為酒黃精飲片。無水D-葡萄糖對照品(批號110833-201205，中國食品藥品檢定研究院)。濃硫酸、苯酚購于天津市凱信化學工業有限公司，所用試劑均為分析純。

2 方法

2.1 酒黃精多糖的制備

將酒黃精樣品用粉碎機粉碎，用石油醚回流脫脂2次，每次回流3 h。稱取10 g脫脂酒黃精，以水為介質，按一定料液比、超聲時間、溫度提取，真空抽濾，離心去沉淀取上清液，用Sevage試劑(氯仿-正丁醇4:1)脫蛋白3次，溶液離心15 min(4 000 r·min-1)，所得上清液進行抽濾，抽濾的上清液用4倍量80%乙醇沉淀，最后冷凍干燥沉淀物為酒黃精多糖[16]，待用時，用蒸餾水配比為一定濃度。

2.2 酒黃精多糖的測定

采用苯酚-硫酸法進行酒黃精多糖測定，參照杜鵬瑤等[17]的方法，略有修改。稱取25 mg葡萄糖溶解于適量的水中，然后定容于250 mL容量瓶中，配置成濃度為0.1 mg·mL-1的葡萄糖標準溶液。分別吸取上述標準溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL，置于25 mL刻度試管中，依次加蒸餾水使其定容至2 mL，另以2 mL蒸餾水作為空白對照。然后加入1 mL濃度為5%的苯酚溶液，繼續加入5 mL濃硫酸，置入4℃水浴中10 min，取出置于室溫。每個刻度試管中取出200 μL溶液加入96孔酶標板中，用酶標儀在490 nm波長處測定其吸光度，所制得葡萄糖標準曲線為y=14.388x+0.1073，R2=0.999，線性關系良好。

酒黃精多糖含量的測定：取2 mL上述樣品，加入1 mL濃度為5%的苯酚溶液，混勻，在加入5 mL濃硫酸溶液，搖勻放入冰水浴中10 min，取出放置室溫，在波長490 nm處測其吸光度值。利用所得方程式計算出黃精多糖的得率，計算公式如下：

酒黃精多糖提取率(%)=(葡萄糖質量濃度×稀釋倍數×提取液體積)/樣品質量×100%

2.3 單因素試驗

按照“2.1、2.2”項工藝流程，每次稱取10 g酒黃精預處理粉末，考察3個因素對酒黃精多糖提取率的影響。單因素條件如表1所示。

表1 單因素條件

2.4 響應面優化

在單因素的基礎上，確定提取料液比(A)、超聲時間(B)、超聲溫度(C)3個因素，用Box-Behnken響應面法優化3因素3水平試驗，試驗因素水平及編碼見表2。

表2 試驗因素水平及編碼

2.5 酒黃精多糖抗氧化活性的研究

2.5.1 對DPPH自由基的清除作用 參照許女和馮書珍兩人[18-19]的方法進行DPPH自由基清除測定，取1 mL不同質量濃度的酒黃精多糖溶液，加入1 mL用無水乙醇作為溶劑制成0.1998 mmol·L-1DPPH溶液，置于避光條件下30 min，取200 μL待測液加入酶標板中，用全波長掃描酶標儀在517 nm處測定其吸光度(AS)，無水乙醇溶液代替DPPH乙醇溶液測定AC，蒸餾水代替酒黃精多糖溶液測定A0。清除率計算公式如下：

清除率/%=1-(AS-AC)/A0×100%

2.5.2 酒黃精多糖提取物對細胞抗氧化活性的作用 酒黃精多糖的細胞抗氧化活性評價采用Wolfe的方法[20]。將100μL培養好的SW620細胞接種于96孔板中(每孔細胞數計數為6×104個)，每個濃度樣品重復4個平行，放置于37℃、5%CO2細胞培養箱中貼壁培養20 h，然后取出棄去上清液，用無血清培養基將每孔各清洗一次。然后各孔依次加入用100 μl完全培養基配制的不同濃度的酒黃精多糖提取物和槲皮素標準液，空白各孔和對照各孔加入完全培養基替代樣品提取液。將96孔板繼續放入細胞培養箱中孵育1 h，然后取出并棄掉各孔上清液，每孔加入100 μL PBS鹽水清洗一次，每孔再分別加入100 μL濃度為600 μmol·L-1的AAPH溶液(空白孔加入濃度為10 mmol·L-1Hepes的HBSS溶液)，然后用酶標儀在490 nm波長條件下檢測各孔熒光值，按照標準檢測方法檢測細胞抗氧化活性(CAA值)，并以μmol槲皮素當量/100 g樣品(μmol QE/100 g樣品)來表示。

3 結果與分析

3.1 不同提取條件下單因素實驗結果

料液比對酒黃精多糖得率的影響如圖1所示。當料液比在1:20～1:30(g·mL-1)之間時，得率呈現上升趨勢；當料液比為1:30(g·mL-1)時，得率為7.6%，達到最大，；當料液比在1:30～1:40(g·mL-1)之間時，得率隨料液比的增加而下降，因此以料液比為1:30最為合適。

圖1 料液比對酒黃精多糖得率的影響

超聲時間對酒黃精多糖得率的影響如圖2所示。當超聲時間在20～30 min范圍內時，得率呈現上升趨勢；當超聲時間為30 min時，得率為7.56%，達到最大；當超聲時間在超過30 min，得率隨時間的增加而下降；可能是因為過長時間的超聲破壞了多糖分子鏈穩定性，導致得率降低，因此，超聲時間為30 min最為合適。

圖2 超聲時間對酒黃精多糖得率的影響

超聲時間對酒黃精多糖得率的影響如圖3所示。當超聲時間在30～40℃范圍內時，得率隨超聲溫度呈現上升趨勢；當超聲溫度為40℃時，得率為7.52%，達到最大；當超聲溫度在40～50℃范圍內時，得率隨溫度的增加而下降；因此，超聲時間為40℃最為合適。

圖3 超聲溫度對酒黃精多糖得率的影響

3.2 響應面優化提取條件

3.2.1 響應面試驗結果分析 采用Box-Behnken響應面設計試驗，根據表1中3因素3水平編碼設計試驗方案，結果與分析如表2，方差分析結果見表3。

表3 酒黃精多糖提取工藝優化響應面試驗結果與分析

通過Design-Expert.V8.0.6軟件進行回歸分析，得料液比、超聲時間和溫度對酒黃精多糖提取率影響的二次多項回歸方程：Y=7.58-0.018A-0.056B-0.036C-0.042AB-0.018AC-0.06BC-0.2A2-0.13B2-0.076C2。由表3可知，該模型達極顯著水平(P<0.01)，失擬項不顯著(P=0.5991>0.05)。所以，該二次方程模型擬合度較好，能夠準確反映3因素對酒黃精多糖提取率的影響，表明此模型適用于工藝優化。從表3可以看出，一次項B和二次項A2、B2、C2對結果影響極顯著(P<0.01)，一次項C和交互項BC對響應值影響顯著(P<0.05)，一次項A和交互項AC、AB對響應值影響不顯著(P>0.05)。通過比較個性F值可知，對酒黃精多糖提取率影響最大的是超聲時間，其次是超聲溫度，最小的是料液比。

表4 回歸模型的方差分析

注：##P<0.01，差異極顯著；#P<0.05，差異顯著。

3.2.2 響應面圖分析 通過多元回歸方程作三維效應曲面圖和二維平面等高線圖，從圖4可以直觀分析三個因素之間交換作用以及對多糖得率的影響。

由圖4可知，A與B、A與C對酒黃精多糖得率的影響均不顯著(P>0.05)，B與C交互作用顯示，B變化曲面比C變化曲面陡峭；等高線沿B方向變化稍高于C方向呈橢圓形，表明B對響應值的影響比C稍大，二者之間交互作用顯著(P<0.05)。

圖4 A與B、A與C、B與C對酒黃精多糖提取率的響應面圖和等高線

3.2.3 最佳條件優化及驗證 根據響應面分析確定最佳工藝參數為：料液比為1∶32.84(g·mL-1)，超聲時間為28.69 min，超聲溫度38.99℃，對應酒黃精多糖提取率為7.52%。考慮試驗操作的方便性，調整各因素為整數，料液比為1∶33(g·mL-1)，超聲時間為29 min，溫度39℃，在上述條件下進行3次平行試驗，得出酒黃精多糖實際得率為(7.49±0.08)%，與回歸方程預測值基本符合，所以該模型有效。

3.3 抗氧化活性

3.3.1 酒黃精多糖對DPPH清除作用 從圖7可知，酒黃精多糖濃度與DPPH自由基的清除率呈現正相關的趨勢，在從0.2～0.92 mg·mL-1范圍內呈一定量效關系。當酒黃精多糖質量濃度為0.9104 mg·mL-1時清除達到76.50%。

圖5 不同濃度酒黃精多糖對DPPH·的清除作用

3.3.2 酒黃精多糖對細胞抗氧化活性的影響 采用CAA法對酒黃精多糖提取物細胞抗氧化活性評價表明(圖8)，根據預實驗結果選取5～80 μg·mL-1作為工作濃度，酒黃精多糖抗氧化活性呈正相關，限值為80 μg·mL-1(工作濃度)，具有最大的細胞抗氧化活性CAA值(12.31±0.78 μmol QE·100 g-1)。初步證實該提取法所得的酒黃精多糖都具有抗氧化活性，并呈濃度依賴性。

圖6 超聲法提取酒黃精多糖細胞抗氧化(CAA)活性

4 結論

筆者實驗在單因素試驗的基礎上，采用Box-Behnken響應面法設計試驗并及優化酒黃精多糖的超聲提取工藝，所得的二次方程模型擬合度較好，失擬項不顯著(P=0.5991>0.05)，擬合度好，能夠準確地反應料液比、超聲時間、溫度對酒黃精多糖提取率的影響。所得最佳工藝條件為：料液比1∶33，超聲時間29 min、超聲溫度39℃。在此最優提取條件下，提取時間短，酒黃精多糖提取率高達7.49%。通過抗氧化研究發現，當酒黃精多糖濃度在0.2～0.92 mg·mL-1范圍內呈一定量效關系，酒黃精多糖質量濃度為0.9104 mg·mL-1時清除達到76.50%。當酒黃精多糖濃度在5～80 μg·mL-1作為工作濃度時，抗氧化活性與濃度呈正相關，限值為80 μg·mL-1(工作濃度)，具有最大的細胞抗氧化活性CAA值(12.31±0.78 μmol QE·100 g-1)，表明酒黃精多糖具有一定的抗氧化能力。利用超聲波法對酒黃精多糖進行提取，可以節約時間，提升工作效率。酒黃精具有較大的開發潛力，本研究可為酒黃精的綜合開發利用提供理論依據。