磷酸化對UCHL3體外去泛素化酶活性的影響

丁 珊, 任禹靜,2, 姜 凌, 梅子青*

1.中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081;2.北京理工大學生命學院, 北京 100081

泛素化修飾是指通過泛素激活酶(ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素結合酶(ubiquitin-conjugating enzyme，E2)以及泛素連接酶(ubiquitin-protein ligase，E3)等一系列酶促級聯反應將靶點底物蛋白通過其上賴氨酸的側鏈氨基與泛素分子C末端甘氨酸(Gly76)以異肽鍵相連而被共價修飾的過程[1]。泛素化修飾是真核細胞內重要的蛋白質翻譯后修飾方式，幾乎在所有生命活動中都發揮著重要作用，如蛋白質的降解、信號轉導以及DNA損傷修復等[2～4]。由于泛素分子具有自由的氨基，其N端甲硫氨酸和7個賴氨酸(M1、K6、K11、K27、K29、K33、K48、K63)均可與其他參與泛素鏈形成的泛素蛋白分子上的Gly76的羧基縮合形成肽鍵/異肽鍵，進而形成鏈接類型更為復雜的多聚泛素鏈。眾多研究已表明，不同鏈接類型的泛素鏈會介導底物蛋白參與不同的生命過程[5,6]。

與E1-E2-E3負責的泛素化過程相反，去泛素化是泛素化修飾的逆過程，由去泛素化酶負責完成[7～9]。真核細胞的去泛素化酶(deubiquitinating enzymes，DUBs)主要包含6個家族：泛素特異性加工酶(ubiquitin-specific processing proteases，USPs)家族、UCH家族、卵巢腫瘤蛋白酶(ovarian tumour proteases，OTUs)家族、Jab1/Pab/MPN結構域金屬酶(Jad1/Pad/MPN domain containing metallo-enzymes，JAMM)家族、馬查多-約瑟夫病相關酶(Machado-Joseph disease related enzymes，MJD)家族和單核細胞趨化蛋白1誘導蛋白(monocyte chemotactic protein-induced protein，MCPIP)家族。UCHL3蛋白是UCH家族的重要成員，其可催化Ⅰ型干擾素受體的去泛素化，從而調控Ⅰ型干擾素介導的抗病毒作用[10]。研究表明，UCHL3在成骨細胞中過表達，可對信號轉導蛋白Smad(drosophila mothers against decapentaplegic protein)家族中的Smad1進行去泛素化調控[11]。另有研究報道，UCHL3在乳腺癌細胞內高表達[12]，是乳腺癌細胞對放療和化療產生抗性的根源[13]，因而，近年來，靶向抑制UCHL3蛋白已成為乳腺癌治療的新思路。此外，UCHL3被發現可通過對RAD51(DNA repair protein RAD51 homolog 1，DNA雙鏈斷裂修復蛋白)進行去泛素化，參與DNA損傷修復調節[13]；其還可通過對TDP1(tyrosyl DNA phosphodiesterase l，調控修復拓撲異構酶介導的染色體斷裂的關鍵蛋白)去泛素化，調控染色質斷裂修復[14]。

在相當長時間內，UCHL3一直被認為只能對單泛素及其綴合物、或者泛素結合酶與泛素的復合物進行切割，而不能對泛素鏈進行切割[15,16]。2016年，Luo等[13]首次發現UCHL3上Ser75發生磷酸化后，可對底物RAD51多聚泛素鏈進行切割，但是，這項研究均為體內實驗結果，磷酸化賦予UCHL3切割多聚泛素鏈活性的結論尚缺少體外實驗證據的支持。

基于此，本研究利用點突變方法將UCHL3上的Ser75突變成Glu，實現模擬磷酸化修飾，并使用親和層析、離子交換層析及凝膠過濾層析等多種純化技術，在大腸桿菌中異源重組表達并純化到了性質均一的野生型UCHL3(UCHL3WT)和模擬磷酸化的UCHL3蛋白(UCHL3S75E)，進而在體外生化水平上研究磷酸化對UCHL3的泛素鏈切割活性的影響，以期為深入了解其受翻譯后修飾調控的分子機制奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

質粒pET-28a_UCHL3WT為本實驗室保存；DH5α感受態細胞、BL21(DE3)感受態細胞購于北京全式金生物技術有限公司。

Q5 DNA聚合酶、DpnⅠ酶均購于美國NEB公司；牛血清白蛋白購自北京信科奧達科技有限公司；雞卵清白蛋白購自美國Sigma公司；苯甲基磺酰氟(phenylmethylsulfonyl fluoride，PMSF)購自美國Thermo Fisher Scientific公司；Bradford試劑購自美國Bio-Rad公司。Ub-AMC和K27、K48以及K63鏈接類型二泛素(K27 diub、K48 diub、K63 diub)均為清華大學劉磊教授實驗室贈送。其他主要試劑均購于美國Sigma公司。

HitrapQ層析柱、Superdex 200凝膠過濾層析柱均購自美國GE醫療公司。

1.2 實驗方法

1.2.1基因克隆 研究所用目的基因來源于人源cDNA，在本實驗室已有的pET28a_UCHL3質粒的基礎上，利用QuikChange定點誘變技術構建點突變質粒，將Ser75突變為Glu[17]。設計上游引物為：5′-GAAAAAATAAAAgagCAGGGACA-AGATGTTACATC-3′，下游引物為：5′-gaaTTTTATT-TTTTCTTCCTCTTCTGTTC-3′(小寫部分為突變位點)。引物由華大基因公司進行合成。PCR反應體系(共20 μL)為：野生型UCHL3質粒模板0.4 μL，上、下游引物各0.4 μL，5×Q5緩沖液4 μL，5×Q5 Enhancer 4 μL，dNTP 1.6 μL， Q5 DNA聚合酶0.2 μL，滅過菌的去離子水9 μL。PCR反應程序為：95℃ 10 min；95℃ 30 s，58℃退火30 s，72℃延伸3 min，共25個循環；72℃延伸5 min。PCR產物經瓊脂糖凝膠電泳驗證后，使用DpnⅠ酶在37℃酶切消化3 h。隨后，將消化產物轉化進DH5α感受態細胞中，并涂布于含卡那霉素的LB平板，37℃過夜培養，挑取單克隆，送至華大基因公司進行測序，將成功構建的pET28a_UCHL3S75E質粒于-20℃保存備用。

1.2.2蛋白表達與純化 將pET28a_UCHL3S75E質粒轉化進BL21(DE3)感受態細胞后，接入50 mL LB液體培養基中，37℃、220 r/min搖床培養3～4 h。隨后轉接至1 L LB液體培養基中進行擴大培養(37℃、220 r/min)；待菌體生長至OD600=1.0時，加入異丙基-β-D-硫代半乳糖苷(isopropyl-β-D-thiogalactoside，IPTG)至終濃度為0.2 mmol/L，于22℃誘導培養12～16 h。pET28a_UCHL3WT質粒誘導表達的方法同pET28a_UCHL3S75E質粒。

分別將誘導培養的菌液在4℃、4 000 r/min條件下離心15 min，收集菌體后，用Lysis Buffer(25 mmol/L的pH 8.0 Tris、150 mmol/L NaCl)重懸，并加入0.3 mmol/L PMSF，超聲破碎(600 W功率下超聲3 s，停止9 s，總共超聲30 min)。在4℃、13 000 r/min條件下離心50 min去除沉淀后，利用鎳柱進行親和層析純化，使離心所得上清液與柱料充分結合后，用25 mmol/L的pH 8.0 Tris、500 mmol/L NaCl進行第1次清洗(W1)，再用25 mmol/L的pH 8.0 Tris、10 mmol/L咪唑進行第1次洗脫(E1)，最后用25 mmol/L的pH 8.0 Tris、150 mmol/L咪唑進行二次洗脫(E2)。選擇較好的洗脫液進行下一步陰離子交換層析HitrapQ以及凝膠過濾層析Superdex 200純化，最終得到高純度、高質量的目的蛋白。

1.2.3利用Bradford法測定蛋白濃度 配制不同濃度梯度的牛血清白蛋白(包括0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.375 mg/mL以及0.5 mg/mL)；分別取10 μL各濃度梯度的牛血清白蛋白，加入1 mL Bradford試劑中，檢測OD595讀值；重復3次，并取平均值，進而制作牛血清白蛋白濃度對OD595的標準曲線。另取1 mL Bradford試劑，加入10 μL稀釋后的UCHL3WT或UCHL3S75E蛋白，進行OD595數據測定，并利用標準曲線分別計算UCHL3WT以及UCHL3S75E的蛋白濃度。

1.2.4Ub-AMC切割活性實驗 參照Lee等[18]的方法，利用Ub-AMC切割活性實驗來驗證模擬磷酸化對UCHL3蛋白功能的影響。向包含50 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)、1 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)、1 mg/mL雞卵清白蛋白、5 mmol/L ATP/MgCl2、1 mmol/L二硫蘇糖醇(dithiothreitol，DTT)的反應體系中分別加入濃度為5 nmol/L的UCHL3WT和UCHL3S75E蛋白，再加入65 μmol/L Ub-AMC來啟動反應。Ub-AMC的水解活性主要通過Synergy HT多功能酶標儀(美國BioTek公司)在Ex360/Em460處進行實時檢測。每30 s記錄1次熒光強度，共記錄15 min。每個實驗重復3次，并計算平均值。

1.2.53種不同鏈接類型二泛素的切割活性實驗

基于此前對UCHL3與二泛素的相互作用力的測定結果[19]，選擇3種不同鏈接類型的二泛素(K27 diub、K48 diub、K63 diub)作為底物，來進行比較UCHL3WT與UCHL3S75E(4 μmol/L)的二泛素切割活性實驗。同時，選擇OTUD2(一種去泛素化酶)作為陽性對照。在25 mmol/L的pH 8.0 Tris、150 mmol/L NaCl反應體系中進行反應。分別加入3種酶(OTUD2、UCHL3WT、UCHL3S75E)啟動反應，在不同時間點(0 min、120 min，UCHL3S75E實驗組還包括60 min)取樣，最后通過SDS-PAGE來檢驗切割活性。

1.2.6UCH家族多序列比對及系統發育樹構建

利用Uniprot網站(https://www.uniprot.org/)查找UCH家族中成員(UCHL3、UCHL1、UCHL5和BAP1)的蛋白質序列，使用DNAMAN軟件進行多序列比對，使用MEGA-X軟件構建系統發育樹。

利用NCBI網站BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)查找UCHL3在不同物種中的同源蛋白(包括小鼠Musmusculus、果蠅Drosophilanavojoa、水稻Oryzasativa、玉米Zeamays以及擬南芥Arabidopsisthaliana)，使用DNAMAN進行多序列比對，使用MEGA-X軟件構建系統發育樹。

2 結果與分析

2.1 UCHL3S75E質粒的構建

為了獲得模擬磷酸化的UCHL3蛋白，通過QuikChange定點誘變技術構建pET-28a_UCHL3S75E質粒。如圖1所示，目的條帶在5 000 bp～10 000 bp之間，與預測分子量(6 062 bp)基本相符。同時，測序結果顯示本研究克隆的UCHL3S75E基因序列完全正確。

2.2 UCHL3WT和UCHL3S75E蛋白的純化

為了獲得高純度、高質量的UCHL3WT和UCHL3S75E蛋白，利用大腸桿菌BL21(DE3)對其進行表達并嘗試利用多種層析技術進行純化。如圖2所示，經過親和層析、離子交換層析和凝膠過濾層析多步純化，UCHL3WT蛋白的純度超過90%(圖2A)，在Superdex 200的洗脫體積為16.5 mL左右，對應分子量大小正確。SDS-PAGE顯示其分子量在21～33 kDa，與目的蛋白的預測分子量26 kDa相一致。圖3為UCHL3S75E蛋白的純化結果，表明其純度、洗脫體積和分子量與UCHL3WT類似。

圖1 pET-28a_UCHL3S75E(6 062 bp)PCR鑒定Fig.1 The PCR identification of pET-28a_UCHL3S75E(6 062 bp).

圖2 UCHL3WT蛋白純化結果Fig.2 The purification of UCHL3WT protein.注：A: UCHL3WT 親和層析純化結果以及SDS-PAGE鑒定；B: UCHL3WT Hitrap Q陰離子交換層析及SDS-PAGE鑒定；C: UCHL3WT SD 200凝膠過濾層析純化及SDS-PAGE鑒定。

2.3 蛋白濃度測定

為了獲得準確的蛋白濃度，測定并擬合了蛋白濃度測定標準曲線，并根據擬合曲線以及蛋白稀釋倍數計算得到待測蛋白濃度。其中，UCHL3WT為2.8 mg/mL(16.8 μmol/L)、UCHL3S75E為2.4 mg/mL(14.5 μmol/L)。

2.4 磷酸化對Ub-AMC切割活性的影響

為了理解磷酸化對UCHL3活性影響，對UCHL3切割Ub-AMC的活性進行了分析。如圖4A所示，相比于UCHL3WT蛋白，模擬磷酸化的UCHL3S75E切割Ub-AMC的活性明顯升高。經Origin軟件分析可知，在同等酶量以及底物濃度條件下，UCHL3S75E的切割活性比UCHL3WT提高了70%。

2.5 磷酸化對二泛素切割活性的影響

為了探索磷酸化對UCHL3切割二泛素活性的影響，采用不同鏈接類型的二泛素作為底物，進行了相關的酶切活性實驗。如圖4B、4C和4D所示，作為陰性對照，單獨的K27、K48以及K63等鏈接類型二泛素在不加酶的體系中保持不變；作為陽性對照，OTUD2可對上述3種類型二泛素實現有效切割。相比之下，UCHL3WT對上述3種二泛素均不具備切割活性，模擬磷酸化的UCHL3S75E對K27、K48鏈接類型二泛素也不具備切割活性，但對K63鏈接類型二泛素展現出微弱的切割活性，不過此活性遠遠小于生理水平切割活性。

2.6 UCH家族多序列比對以及系統發育樹分析

為了驗證該種磷酸化調控機制在UCH家族中的保守程度，進行了相應的多序列比對以及系統發育樹分析。如圖5A所示，磷酸化位點Ser75僅存在于UCHL3中，在UCH家族其他3個成員中均不保守，即便是在與其親緣關系最為接近的UCHL1中也不保守(圖5A、5B)。隨后，為了驗證該種磷酸化調控機制在不同物種中的保守程度，進行了不同物種中UCHL3同源蛋白的多序列比對以及系統發育樹分析(圖5C、5D)。結果顯示，Ser75位點在小鼠、果蠅、水稻和玉米中均保守存在，僅在擬南芥中突變成了Glu(圖5C)。而由系統發育樹可知，人源UCHL3與小鼠中UCHL3親緣關系較近，而水稻和玉米中UCHL3蛋白親緣關系較近，模式生物果蠅以及擬南芥與其他物種中UCHL3蛋白親緣關系較遠(圖5D)。

圖4 UCHL3S75E 以及UCHL3WT酶對Ub-AMC以及不同類型二泛素分子的切割活性反應Fig.4 The cleavage activity of UCHL3WT and UCHL3S75E towards Ub-AMC and different types of ubiquitin-linked chains.注：A: 5 nmol/L濃度下，UCHL3S75E 以及UCHL3WT對Ub-AMC的酶切反應及速率分析；B: UCHL3S75E 以及UCHL3WT對K27鏈接類型二泛素酶切反應的SDS-PAGE檢測結果；C: UCHL3S75E 以及UCHL3WT對K48鏈接類型二泛素酶切反應的SDS-PAGE檢測結果；D: UCHL3S75E以及UCHL3WT對K63鏈接類型二泛素酶切反應的SDS-PAGE檢測結果。

圖5 UCH家族成員以及不同物種UCHL3序列對比及系統發育樹構建Fig.5 Sequence alignment and phylogenetic trees of UCH family and UCHL3 sequence of different species.注：A: UCH家族成員成員多序列比對結果,其中黃色代表4種蛋白中保守度為100%的氨基酸；青色代表保守度大于75%的氨基酸；紅色框代表UCHL3中磷酸化位點Ser75及其在其他家族成員中對應的氨基酸。B: UCH家族系統發育樹。C: 不同種屬來源的UCHL3之間序列對比。D: 不同種屬來源的UCHL3系統發育樹構建。

3 討論

作為UCH家族的重要成員，去泛素化酶UCHL3參與了DNA損傷修復[13]、染色質斷裂[20]以及成骨細胞分化[11]等眾多重要生命過程。在被發現后的很長時間內，UCHL3一直被認為只能對單泛素及其綴合物，或者泛素結合酶與泛素的復合物進行切割，而不能對泛素鏈進行切割[15,16]。但近期的一些研究顯示，UCHL3在細胞內可對Smad1、Rad51等底物上的多聚泛素鏈進行切割[10,13,21]，尤其是受到磷酸化修飾后，該活性明顯增強。這些工作暗示UCHL3在細胞內的去泛素化酶活性可能受到翻譯后各種修飾的調控。由于至今為止尚未有任何體外實驗顯示UCHL3WT具有切割泛素鏈的活性[15,16]，因此關于UCHL3切割泛素鏈的活性缺乏體外證據。如果UCHL3的體內活性報道真實，則很可能是細胞內UCHL3在表達后受到了關鍵的翻譯后修飾。而原核系統表達的UCHL3由于沒有修飾，不具備切割泛素鏈的活性。因此，展開UCHL3的體外修飾研究將對該問題做出一定程度上的闡釋。

Ser突變為Glu是常用的模擬磷酸化策略，在很多蛋白激酶的體外研究中有過成功案例。在近期的去泛素化酶翻譯后修飾研究中，無活性的USP14在模擬磷酸化后展現了對Ub-AMC的切割活性[22]。本研究正是基于先前的模擬磷酸化成功案例進行實驗設計，利用點突變技術將Ser75突變為Glu，成功構建模擬磷酸化的UCHL3S75E，并純化得到性質均一的UCHL3S75E蛋白，隨后進行體外去泛素化酶的活性測定。首先，在5 nmol/L濃度下，UCHL3S75E切割Ub-AMC的活性比UCHL3WT提高了70%，顯示了模擬磷酸化對UCHL3活性的調控作用。其次，UCHL3WT沒有展現對K27 diub、K48 diub和K63 diub等二泛素的切割活性[16];出人意料的是，UCHL3S75E也沒有展現出對這3種鏈接類型二泛素的生理水平切割活性。這些結果首次提供了UCHL3磷酸化之后活性提高的體外證據，一定程度上支持了UCHL3受磷酸化調控的理論。同時，這些結果也暗示UCHL3切割泛素鏈可能存在尚未發現的、更為復雜的分子機制。

在本課題組近期解析的UCHL3與K27二泛素復合物的晶體結構中，K27二泛素的2個泛素分子分別占據了UCHL3蛋白表面上的S1以及S2位點[19](圖6)。而去泛素化酶實現切割的前提是2個泛素的異肽鍵應接近于活性中心，即2個泛素分子應分別位于S1和S1’位點。由此推測，UCHL3也許是以二泛素為結合基本單元(在S1和S2位點結合)，對三泛素或者更長的泛素鏈進行切割，更確切地說是對S1與S1’之間的異肽鍵進行切割。結構分析顯示，Ser75的位置正處于UCHL3分子的S1’附近，其磷酸化可能誘導S1’位點結構重排，幫助S1’位點形成接納泛素鏈底物的空間構象，激活UCHL3蛋白對泛素鏈的切割活性。

圖6 UCHL3與K27diub復合物晶體結構及Ser75位置[19]Fig.6 The crystal structure of UCHL3 and K27 diub complex and position of Ser75[19].注：綠色代表UCHL3蛋白；青色和玫紅色代表K27 diub，其中玫紅色泛素分子占據了UCHL3蛋白的S1位點，而青色泛素分子則占據了UCHL3蛋白的S2位點；紅色位點代表UCHL3中Ser75。

此外，盡管UCHL3與UCHL1的親緣關系最近，但Ser75只存在于UCHL3中，在UCHL1中并不存在，表明UCHL3受磷酸化調控的進化獨特性。這與目前的研究結果較為吻合，即UCHL1只能對單泛素及其綴合物進行切割[16]，且并未發現其存在磷酸化調控機制，也未有文獻報道其具備切割多聚泛素鏈的活性。盡管與UCHL1序列同源，可以推測出，正是由于在Ser75位點的不同，UCHL3的底物范圍從單泛素及其綴合物擴展到多泛素鏈，在細胞內已進化成一個真正可以對多泛素鏈底物進行切割的去泛素化酶。當然，這些推測還需要進一步的生物化學以及結構生物學實驗數據加以證實。此外，值得注意的是，Ser75位點在小鼠、果蠅、水稻和玉米中保守存在，但是在擬南芥中卻變成了Glu，暗示著擬南芥中的UCHL3蛋白很可能是組成性活化的，無需其他激酶的磷酸化修飾便可切割泛素鏈。因此，在后續研究中，可以在擬南芥中將組成型活化位點Glu突變為Ser，觀察植株表型變化，探索植株水平上磷酸化調控UCHL3的意義。