羊λ3干擾素在家蠶桿狀病毒表達系統中的表達及其抗病毒活性檢測

王先翔, 趙 澤, 王 朋, 劉興健, 胡小元, 張志芳, 李軼女, 房嶺麗, 葉愛華*

1.安徽農業大學生命科學學院, 合肥 230036;2.中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081

干擾素是機體內一種重要的細胞因子，被發現于20世紀50年代，是研究者們使用滅活的禽流感病毒感染雞胚絨毛尿囊膜時發現的一種細胞分泌物，其能夠干擾和抑制禽流感病毒的復制，故將其命名為干擾素(interferon，IFN)[1]。干擾素可以通過抑制病毒RNA和蛋白質的合成達到抗病毒作用，通過誘導細胞凋亡和自噬來達到抗腫瘤及調節細胞損傷修復和自身免疫等作用[2]。目前，根據作用方式和特性的不同可將干擾素分為Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ三型，其中Ⅰ型干擾素成員最多，具有較強的抗病毒作用，包括IFN-α、IFN-β、IFN-δ、IFN-ζ、IFN-ε、IFN-ν、IFN-κ、IFN-τ、IFN-ω等[3]；Ⅱ型干擾素只有1種成員，即IFN-γ，IFN-γ是通過激活髓樣細胞以消除病原體的細胞因子，主要受抗原提呈細胞(antigen-presenting cells，APC)分泌的細胞因子IL-12和IL-18的控制，這些細胞因子在先天免疫反應中刺激IFN-γ的產生[4]，雖然IFN-γ僅由免疫細胞產生，但幾乎對所有類型的細胞都有作用[5]，尤其在調節免疫功能以及橋接先天性和獲得性免疫中發揮重要作用[6,7]；Ⅲ型干擾素是近些年來新發現的細胞因子，主要為IFN-λ1、IFN-λ2、IFN-λ3，分別被稱為IL-29、IL-28A、IL-28B，此外還有在人體中發現的IFN-λ4[8]。

Ⅲ型干擾素(IFN-λs)在系統發生上與Ⅰ型干擾素和IL-10關系密切，并可與IL-10、IL-22和IL-26相同的受體(IL-10R2)相結合[9]。其另外一個特異性受體分子為IFN-λR1，IFN-λR1主要是在上皮細胞中表達，故IFN-λs曾被認為是上皮細胞因子，在粘膜部位發揮抗病毒等生物學功能[10]。然而，現在越來越多的研究發現IFN-λs在免疫應答調節中發揮著關鍵作用。免疫細胞(如中性粒細胞和樹突細胞)對IFN-λs有反應，IFN-λs可通過刺激中性粒細胞導致Janus激酶/信號轉導和轉錄激活子(Janus kinase/signal transducer and activator of transcription，JAK-STAT)通路激活和STAT1磷酸化而顯示出抗炎功能[11～13]；而利用IFN-λs刺激樹突細胞，能夠激活JAK-STAT通路和上調干擾素誘導基因產物的轉錄，從而刺激其產生Ⅰ型IFN并誘導腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)的表達，對抗腫瘤具有重要意義[14]。此外，IFN-λs與受體結合后，也可激活JAK-STAT通路，從而上調多達數百種干擾素刺激基因(interferon-stimulated genes，ISGs)的轉錄和表達，通過復雜的正負反饋機制調節免疫功能[15]。最近研究表明，IFN-λs對中性粒細胞的作用可以在真菌感染期間保護宿主，顯示了其抗真菌的能力[16]；IFN-λs刺激的樹突狀細胞仍然能夠在脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)刺激下上調轉錄因子T-bet并產生更高水平的IL-12[17]。

羊的干擾素可抑制水泡性口炎病毒、羊的慢病毒等，近來研究發現其對口蹄疫病毒也具有較好的抗病毒活性[18]。羊的干擾素還對繁殖和內分泌起到重要作用，可調節子宮內膜的雌激素、催產素等激素的受體[19]，而且其還可作用于母體子宮內膜以防止黃體溶解因子前列腺素F2α的釋放，預防黃體退化，確保妊娠的持續[20]。

桿狀病毒表達系統是一種高效節時的真核表達系統，Arslan等[21]將桿狀病毒表達系統表達的雞IFN-λ3作用于雞胚細胞后，重要的免疫基因和抗病毒信號通路均有所上調，顯示出其抗病毒的潛力。本實驗室在之前的研究中構建了一種失活拯救型家蠶桿狀病毒穿梭載體reBmBac，其缺失復制必需基因ORF1629，使其獲得重組病毒的效率幾乎高達100%[22]。本實驗室利用此系統已經多次成功高效表達出具有生物活性的外源蛋白，如趙璐璐等[23]使用家蠶桿狀病毒表達系統表達出牛IFN-λ3，檢測其抗水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)活性為(8.1±0.52)×105U/mL。本研究中選用家蠶作為生物反應器來表達目的蛋白——羊λ3干擾素(OvIFN-λ3)，在羊細胞系中檢測其抗病毒活性并篩選純化，以期為羊的抗病手段提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗用家蠶為江蘇科技大學蠶業研究所提供的JY1品種；OvIFN-λ3基因由南京金斯瑞生物科技有限公司合成；大腸桿菌感受態Top10、桿狀病毒轉移載體pVL1393、失活拯救型穿梭質粒、家蠶卵巢傳代細胞(Bm-N)、羊腎上皮細胞和重組表達綠色熒光蛋白的水皰型口炎病毒(VSV-GFP)均由本實驗室傳代、保存。高保真DNA聚合酶和HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit(+ gDNA wiper)購自南京諾唯贊生物科技有限公司；昆蟲細胞培養基(TC-100)購自德國AppliChem公司；哺乳動物細胞培養基和胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)購自美國Gibco公司。

1.2 實驗方法

1.2.1OvIFN-λ3的優化和合成 首先，查找Genbank公布的羊λ3干擾素的氨基酸序列，在得到的多條結果中用序列比對軟件進行比對，選擇共有序列，最終確定登錄號為XP_014962163.1的氨基酸序列。將此序列在不改變氨基酸的前提下根據家蠶密碼子的偏好性進行優化，替換易使mRNA形成發夾結構的密碼子，提高密碼子適應指數(codon adaptation index，CAI)，調整GC含量，去除常用酶切位點后，在兩端分別加入BamHⅠ和EcoRⅠ酶切位點，在起始密碼子ATG前加入Kozak序列(AAC)。交由南京金斯瑞生物科技有限公司使用化學合成法合成優化后的基因，將此基因命名為OvIFN-λ3。

1.2.2轉移載體pVL1393-OvIFN-λ3的構建 合成的優化基因已經構建在pUC57載體上，用BamHⅠ和EcoRⅠ內切酶將目的基因片段剪切下來后進行瓊脂糖凝膠電泳，膠回收，將回收下來的片段與已用BamHⅠ和EcoRⅠ內切酶切好的pVL1393載體片段在T4 DNA連接酶的催化下于22℃連接3 h。再將連接產物轉化至大腸桿菌Top10感受態內，在氨芐固體選擇培養基中挑選出單克隆，經BamHⅠ和EcoRⅠ雙酶切鑒定連接成功后，命名為轉移載體pVL1393-OvIFN-λ3。

1.2.3重組病毒的獲得及其在家蠶中的表達

將轉移載體pVL1393-OvIFN-λ3與本實驗室構建的失活拯救型家蠶桿狀病毒穿梭載體reBmBac DNA在脂質體的介導下共轉染家蠶卵巢傳代細胞Bm-N，27℃培養4～5 d后收集細胞培養液，離心取上清，進行PCR鑒定，根據目的基因來設計引物，上游引物序列為5′-ATGGCTCCTGGCTGCACCTTGGT-3′，下游引物序列為5′-TTAAACACACTGATCTCCGCTA-3′。PCR反應體系(共50 μL)為：模板1 μL，上、下游引物各1 μL，10 μmol/L dNTP 1 μL，10×Buffer 5 μL，DNA聚合酶 1 μL，水 40 μL。PCR程序為：95℃ 5 min；95℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，共30個循環；72℃ 10 min。經PCR驗證后得到含OvIFN-λ3基因片段的重組病毒液。將病毒液按照105pfu/頭的含量注射5齡起家蠶，同時設置陰性對照組，再培養4～5 d后，根據家蠶發病情況收集蠶血淋巴，于-20℃保存。

1.2.4蠶血淋巴基因組DNA的提取 取100 μL蠶血淋巴于EP管中，加入等體積的1 mol/L NaOH，搖勻后室溫放置5 min,再加入20 μL 10 mol/L NH4AC，混勻后室溫放置5 min，終止堿液反應。隨后，加入飽和酚/氯仿/異戊醇(25∶24∶1)混合溶液，搖勻后靜置10 min，4℃、12 000 r/min離心10 min，取上清置于新管中，用2.5倍乙醇沉淀核酸，4℃、12 000 r/min離心10 min后棄上清，再用-20℃預冷的75%乙醇清洗沉淀，4℃、12 000 r/min離心10 min，棄上清后將沉淀烘干，溶于50 μL TE溶液中,置于-20℃保存。

1.2.5蠶血淋巴RNA的提取和反轉錄 取100 μL蠶血淋巴于EP管中，加入1 mL Trizol，混勻后室溫放置5 min，再加入200 μL氯仿，劇烈震蕩后靜置3 min，4℃、12 000 r/min離心15 min后取上層水相移入新EP管，加入等體積異丙醇，搖勻后冰浴5 min，4℃、12 000 r/min離心10 min后棄上清，用-20℃預冷的75%乙醇清洗沉淀后7 500 r/min離心5 min，棄上清后將沉淀烘干，溶于50 μL DEPC水中。經瓊脂糖凝膠電泳查看RNA狀態良好后使用微量分光光度計測定其濃度，使用HiScript Ⅱ 1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，并參照說明書進行反轉錄，將產物置于-20℃保存。

1.2.6OvIFN-λ3重組病毒的構建及其感染和轉錄的PCR鑒定 分別以1.2.4和1.2.5獲得的基因組DNA和反轉錄產物為模板，PCR反應體系和程序同1.2.3。

1.2.7表達產物抗病毒活性檢測 用PBS將1.2.3中收集的蠶血淋巴稀釋10倍后使用超聲破碎儀破碎細胞，12 000 r/min離心10 min后取上清，經0.22 μm膜過濾后分裝待用。采用微量細胞病變抑制法測定干擾素表達產物的抗病毒活性[24]，在羊腎細胞中檢測其對VSV-GFP的抗病毒作用，使用Reed-muench方法來計算其效價。首先將羊腎細胞按照105個/mL的濃度鋪在96孔板(100 μL/孔)上，在37℃、5% CO2濃度的培養箱中培養24 h，將上述分裝的干擾素樣品稀釋1 000倍后，按照3倍梯度稀釋于96孔板中，每孔100 μL體積，設置7個稀釋度，每個稀釋度設置8個復孔為1列，另設1列病毒對照和1列細胞對照。再培養24 h后用100TCID50的VSV-GFP病毒攻毒，約24 h后根據綠色熒光觀察細胞發病情況，計算效價。

1.2.8空斑篩選法篩選重組病毒 將Bm-N細胞接種于35 mm的細胞培養皿中，27℃培養1 d后，用無血清的TC-100培養基將1.2.3中獲得的共轉染產物(含重組病毒的上清)稀釋104倍，取1 mL稀釋液加入到培養皿中；置于27℃昆蟲培養箱中培養1 h后取出，棄上清；加入半固體培養基(含10%胎牛血清和1%低熔點凝膠)培養基，于27℃培養4～6 d，在解剖鏡下觀察病毒感染細胞后所產生的細胞空斑，挑選24個空斑并編號后收集病毒。此過程相當于純化病毒，1個細胞空斑內的所有病毒都來源于同一個親本。將Bm-N細胞均勻鋪在24孔板中，分別接種所收集到的病毒，27℃培養4～6 d后，收集各孔上清，獲得24個毒株，將其分別注射家蠶，待家蠶發病后收集蠶血淋巴進行抗病毒活性檢測。

2 結果與分析

2.1 重組病毒的構建及其感染、轉錄的PCR鑒定

用BamHⅠ和EcoRⅠ將構建好的載體pVL1393-OvIFN-λ3進行雙酶切鑒定，隨后經1%瓊脂糖核酸電泳分離出2條帶(圖1A)，目的基因的大小為591 bp，pVL1393載體大小為9 607 bp，電泳結果與預期一致。將酶切驗證正確的質粒交由公司測序，返回結果經MEGA比對基因序列后顯示完全一致，證明轉移載體pVL1393-OvIFN-λ3構建成功。

提取蠶血淋巴基因組后，通過PCR驗證目的基因重組病毒的構建及其感染、轉錄的情況。目的基因的大小為591 bp，PCR成功擴增且大小與其相符(圖1B)，將條帶膠回收后交由公司測序，返回結果顯示目的基因已成功重組并感染家蠶。以蠶血淋巴RNA反轉錄后得到的cDNA產物為模板，同樣用上述引物進行PCR鑒定，得到的產物經瓊脂糖凝膠電泳鑒定大小相符(圖1C)后送測序，返回結果顯示其已在家蠶中進行轉錄。

2.2 抗病毒活性檢測

利用微量細胞病變抑制法檢測OvIFN-λ3的抗病毒活性。GFP的吸收峰在495 nm左右，使用熒光顯微鏡在紫外光波段下觀察細胞，有綠色熒光出現表示病毒感染細胞并大量復制。攻毒次日每2 h觀察1次，待病毒對照組的8個復孔均出現綠色熒光時開始記錄。結果(圖2)顯示，高濃度的干擾素能夠完全抑制病毒感染和復制，無綠色熒光出現；隨著稀釋度的提升，干擾素對細胞的保護作用降低，個別孔開始出現綠色熒光；細胞對照組的細胞狀態良好，無綠色熒光出現。根據不同稀釋度出現綠色熒光的孔數來反映干擾素對細

圖1 pVL1393-OvIFN-λ3重組質粒酶切鑒定(A)和重組病毒感染家蠶(B)并在家蠶中轉錄(C)Fig.1 Restriction enzyme analysis of recombinant transfer vector pVL1393-OvIFN-λ3 (A) and the infection (B) and transcription (C) of recombinant baculovirus.注：A：M: DNA marker，1：pVL1393-OvIFN-λ3重組質粒雙酶切產物，2：陰性對照(pVL1393載體)；B：M：DNA marker，1：以樣品蠶血基因組為模板的PCR產物，2：對照蠶血的基因組為模板的PCR產物；C：M：DNA marker，1：以cDNA為模板的PCR產物，2：以提取的RNA為模板的PCR產物。

圖2 羊腎細胞感染VSV-GFP后發病情況Fig.2 The morbidity of Ovis aries kindly cells infected with VSV-GFP.A：高濃度干擾素完全抑制VSV復制；B：低濃度干擾素對細胞部分保護；C：病毒對照組；D：細胞對照。

胞的保護作用，若某一孔出現綠色熒光，則在對應表格上記為+，否則記為-，結果如表1所示，使用Reed-Muench方法計算其效價，并進行重復實驗后計算其結果為(6.5±0.27)×105U/mL血淋巴。

2.3 重組病毒的篩選

將篩選純化后得到的24個重組病毒分別感染5齡起家蠶幼蟲，待發病后收集血淋巴進行抗病毒活性檢測，測定結果如圖3所示，0號為未篩選的共轉染產物直接感染家蠶后的蠶血淋巴效價，為(6.5±0.27)×105U/mL血淋巴，而篩選的24個樣品中，6號效價最高，為(3.1±0.42)×106U/mL血淋巴。

表1 家蠶幼蟲血淋巴中OvIFN-λ3的抗病毒活性Table 1 Antiviral activity assays of recombinant OvIFN-λ3 in haemolymph of silkworm larvae.

注：“-”表示無綠色熒光；“+”表示有細胞顯示綠色熒光；陰性對照：羊腎細胞+VSV-GFP；細胞對照：僅羊腎細胞。

圖3 不同重組病毒表達OvIFN-λ3的活性測定Fig.3 Antiviral activity assay of OvIFN-λ3 expressed by recombinant baculovirus.注：0：未篩選的共轉染產物；1～24：篩選的24個樣品。

3 討論

本研究成功利用家蠶桿狀病毒表達系統高效表達出具有生物學活性的羊λ3干擾素。該系統中桿狀病毒的復制必需基因ORF1629的刪除使得共轉染過程中的重組率理論上為100%，其含誘導型大腸桿菌復制子，可在大腸桿菌中操作，易進行進一步的改良；同時，桿狀病毒本身基因組較大，可攜帶較大片段外源基因，并且敲除了病毒基因組中降解外源基因的蛋白酶基因和幾丁質酶基因。此外，該系統在表達出外源蛋白后會對其進行一系列加工修飾過程，如糖基化、乙酰化等，比較適用于真核蛋白的表達，有利于其形成類似天然蛋白的高級結構，提高生物學活性。相對于其他表達系統，家蠶桿狀病毒表達系統表達量更高，可批量表達，且桿狀病毒不能在脊椎動物中復制，對脊椎動物無害，生物安全性較好，使得其在生產上具有重要意義。因而，使用桿狀病毒表達系統表達羊的干擾素具有表達量高、抗病毒活性好的優點，如邵麗萍等[25]使用家蠶桿狀病毒表達出羊IFN-γ，對產物進行抗VSV活性檢測，結果顯示其效價可達1.6×106U/mL。本研究利用家蠶桿狀病毒表達系統表達出羊λ3干擾素，初始效價為(6.5±0.27)×105U/mL，隨后利用空斑篩選法篩選重組病毒，感染家蠶后，測定其效價最高可達(3.1±0.42)×106U/mL。

由于密碼子具有簡并性，不同物種密碼子的偏好性也不同，密碼子偏好性優化是提高異源蛋白表達量的有效方式[26]。因此，得到OvIFN-λ3基因序列后，在不改變氨基酸序列的前提下，根據家蠶的密碼子偏好性對其進行優化，提高CAI值，調整GC含量；另外，刪除了原有序列中的一些常用酶切位點，并在序列兩端加上酶切位點；還在起始密碼子前加上Kozak序列，其可與翻譯起始因子結合而介導含有5′帽子結構的mRNA翻譯起始，從而提高目的蛋白的表達量[14]。微量細胞病變抑制法是測定干擾素活性的常用方法，在本研究中采用VSV-GFP病毒系統攻毒，可根據綠色熒光蛋白的表達情況反映干擾素對細胞的保護作用，避免了細胞狀態、主觀判斷等因素對實驗結果的影響，多次重復試驗后，OvIFN-λ3的抗病毒效價基本平穩，可達到(3.1±0.42)×106U/mL血淋巴。

羊的養殖是畜牧業中重要的一環，而口蹄疫、羊痘、寄生蟲等疾病常常威脅著羊的養殖。一般抗生素等藥物具有藥物殘留等缺點，而干擾素的安全性是其他藥物所沒有的，其所具有的抗病毒、抗寄生蟲等潛力對于羊病的預防與治療有一定的積極意義。本研究為利用桿狀病毒表達系統大批量生產廉價的干擾素制劑提供了可能，也為羊干擾素應用于生產疫苗、抗體等生物制品提供了理論依據。未來，可將不同干擾素混合使用，相比單一干擾素，其抗病毒等能力可能會有所提高。