巴斯德畢赤酵母鼠李糖代謝基因LRA3功能及其啟動子順式作用元件的研究

梁明麗, 劉 波, 張 偉

中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081

巴斯德畢赤酵母(Pichiapastoris)是甲醇營養型酵母，由于其具有遺傳操作簡單、胞外分泌表達、高密度發酵及特有的翻譯后修飾等優點而成為常用的真核表達宿主[1]。啟動子作為表達系統必需且重要的元件顯著影響著畢赤酵母表達系統的外源蛋白表達水平[2]。基于啟動子PGAP的畢赤酵母表達系統組成型調控外源基因表達，細胞快速生長即表達目的蛋白，使得細胞生長狀態和生物量相對誘導型啟動子較差，進而降低目的蛋白表達量；此外，當所表達的目的蛋白對宿主細胞生長有損害時，細胞生長狀態和生物量更低，無法高效表達目的蛋白。目前，基于甲醇誘導的甲醇氧化酶基因啟動子PAOX1的畢赤酵母表達系統得以廣泛應用，然而在大規模發酵過程中需要使用易燃的甲醇，存在極大的安全隱患[3]；而且，甲醇為有毒物質，不能滿足食品及生物醫藥等安全性要求極高的重組蛋白生產。因此，挖掘以無毒物質為誘導劑的強啟動子是完善畢赤酵母表達系統的有效途徑。

L-鼠李糖(L-6-脫氧甘露糖)是一種天然六碳糖，是植物果膠和細菌細胞壁的常見組成成分，許多微生物可以利用其作為碳源和能源[4]。目前發現L-鼠李糖代謝主要通過2種途徑：磷酸化途徑和非磷酸化途徑。磷酸化途徑存在于如Escherichiacoli、Clostridiumacetobutylicum、Rhizobiumleguminosarum等大多數細菌中；而非磷酸化途徑則存在于真菌和少數細菌中,完整的代謝途徑基因僅在酵母Scheffersomycesstipitis和Debaryomyceshansenii中闡明[5]。S.stipitis通過4種相關代謝基因(RHA1、LRA2、LRA3、LRA4)編碼的酶將鼠李糖依次轉化為L-鼠李素-Y-內酯、L-鼠李糖酸、3,6-雙脫氧-L-赤式古洛糖，最后轉化為丙酮酸和L-乳醛，二者進入中樞代謝途徑。

研究發現畢赤酵母在以鼠李糖為唯一碳源的培養基上可以正常生長[6]，本實驗室前期預測了畢赤酵母鼠李糖代謝途徑相關基因，挖掘了2個鼠李糖誘導型啟動子PLRA3和PLRA4，其中PLRA3在以鼠李糖為碳源時，轉錄強度可達PGAP的80%，是基于鼠李糖的強誘導型啟動子[6]。由于PLRA3是以無毒鼠李糖為誘導物的強啟動子，因此有望替代PAOX1和PGAP應用于工業生產。為進一步提高基于PLRA3的畢赤酵母表達系統的表達效果，需要對表達宿主和表達載體進行優化。本實驗室在前期的研究中通過菌株改造工程獲得了一株鼠李糖代謝流降低的菌株，在此菌株中PLRA3調控目的蛋白表達量提高了1～2倍[7]。在表達載體優化方面，可以通過PLRA3改良工作提高其轉錄強度進而增強目的蛋白表達效果。此外，已有研究發現，未誘導狀態下，PLRA3表達的毒性蛋白對宿主生長有一定程度的抑制作用，故PLRA3在無鼠李糖誘導時存在微弱的滲漏表達[8]。綜上所述，需要對PLRA3進行理性改造以提高PLRA3誘導轉錄水平、降低滲漏表達，進而提高目的蛋白表達量?；诖?，本研究通過基因敲除和回補實驗探究LRA3基因與畢赤酵母鼠李糖代謝的相關性；另一方面，本實驗室前期研究工作初步確定了PLRA3全長約210 bp，但轉錄元件未能精確鑒定，本研究應用簡單易行的CRRT-PCR方法及生物信息學分析鑒定并預測PLRA3轉錄相關元件，以期為PLRA3下一步理性改造提供科學指導。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1菌株與質粒 巴斯德畢赤酵母菌株P.pastorisGS115為本實驗室保存；pPICZαA質粒購自美國Invitrogen公司；pEASY-Blunt載體及大腸桿菌E.coliTrans1-T1感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司。

1.1.2試劑與儀器 FastPfu DNA聚合酶購自北京全式金生物技術有限公司；瓊脂糖購自莫納生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質粒小提試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；8 kb標準Marker(DM8000)購自北京匯百惠生物科技中心；Trizol試劑和Zeocin抗生素購自美國Invitrogen公司；限制型內切酶(AscⅠ、PacⅠ及SwaⅠ)和DNaseⅠ購自美國Thermo scientific公司；RNA 5′焦磷酸水解酶(RNA pyrophosphohydrolase，RppH)、10×Thermopol Buffer、T4 RNA ligase 1及RNase抑制劑均購自美國NEB公司；5×All-In-One RT MasterMix購自加拿大ABM公司；其他試劑均為進口或國產分析純。

PCR儀器及電穿孔完全系統(美國Bio-Rad公司)；立式冷凍離心機(日本HITACHI公司)；電泳儀(北京君意東方電泳設備有限公司)；凝膠成像分析系統(上海培清科技有限公司)；恒溫金屬浴(金銀杏生物科技(北京)有限公司)；恒溫培養箱(上海一恒科技有限公司)；恒溫培養振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)。

1.1.3培養基 YPR培養基：2%鼠李糖，2%蛋白胨，1%酵母膏。MD固體培養基：2%葡萄糖，2%瓊脂糖，1.34%酵母無氨基氮源(yeast nitrogen base without amino acids，YNB)，4×10-5%生物素。MDH固體培養基：2%葡萄糖，2%瓊脂糖，1.34% YNB，4×10-5%生物素，4×10-3%組氨酸。MRH固體培養基：2%鼠李糖，2%瓊脂糖，1.34% YNB，4×10-5%生物素，4×10-3%組氨酸。

1.2 實驗方法

1.2.1LRA3基因的敲除菌株構建 以GS115基因組為模板，利用引物KO0075-FF/KO0075-FR和KO0075-RF/KO0075-RR(引物序列見表1，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成)分別PCR擴增LRA3基因的上、下游約500 bp片段作為同源重組臂。PCR體系A如下：GS115基因組 1 μL，5×TansStart FastPfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 6 μL，FastPfu 1μL，10 μmol/L上、下游引物各2.5 μL，以ddH2O補至50 μL。PCR程序A為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸20 s，共28個循環；72℃終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定后，用瓊脂糖凝膠回收試劑盒純化回收。

以pPICZαA質粒為模板，用引物zeocin-F/zeocin-R(表1)擴增zeocin抗性基因表達盒。PCR體系及程序同程序A。

表1 本研究所用引物序列Table 1 Primer sequences used in the study.

以LRA3基因上、下游同源臂及zeocin表達盒片段為模板，利用引物對KO0075-FF/KO0075-RR(表1)進行重疊延伸PCR連接3個片段，PCR體系B如下：LRA3上、下游同源臂及zeocin表達盒片段各1 μL，5×TansStart FastPfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 6 μL，FastPfu 1 μL，10 μmol/L上、下游引物各2.5 μL，以ddH2O 補至50 μL。PCR擴增條件B為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，52℃退火30 s，72℃延伸75 s，共4個循環；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸75 s，共25個循環；72℃終延伸10 min。PCR產物經1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定正確后，加入0.8倍體積的異丙醇及0.2倍的3 mol/L醋酸鈉，將以上體系混勻于-20℃靜止0.5 h后，4℃、12 000 r/min離心10 min，輕輕去除上清后加入同體積75%乙醇清洗2次，晾干后加入15 μL ddH2O，取適量回收產物用1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定。

畢赤酵母GS115感受態細胞制備參考相關文獻[9]。將10 μg線性化DNA加入80 μL感受態細胞輕輕混勻，放入預冷電擊杯中電擊轉化，電擊完成后將轉化體系涂布于含100 μg/mL Zeocin的YPD平板，28℃培養36 h。

提取轉化子基因組進行PCR驗證，2對驗證引物為KO0075-VF/zeocin-R(400)及zeocin-F(400)/KO0075-VR(表1)，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時間為1 min。

將PCR驗證陽性轉化子及野生型GS115劃線于MRH平板，觀察其生長情況，將LRA3基因敲除酵母菌株命名為GS115-ΔLRA3。

1.2.2LRA3基因的回補 構建LRA3基因回補的同源重組載體pUCSH-LRA3。通過引物HB-F/HB-R(表1)擴增LRA3基因上、下游基因之間片段，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時間為1 min。AscⅠ、PacⅠ雙酶切pUCSH載體及PCR產物，利用T4 DNA連接酶連接并轉化大腸桿菌克隆菌株Trans1-T1感受態，以HB-F/HB-R為引物進行PCR驗證，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時間為1 min。PCR驗證正確后送生工生物工程(上海)股份有限公司測序，選擇測序正確的質粒進行回補。

質粒經SwaⅠ內切酶線性化后異丙醇醇沉回收。制作GS115-ΔLRA3菌株感受態細胞，將10 μg線性化DNA加入80 μL感受態細胞輕輕混勻，放入預冷電擊杯中電擊轉化，電擊完成后涂布于MD培養基，28℃培養36 h。

提取轉化子基因組進行PCR驗證，通過HB-F/HB-R(表1)驗證，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時間為1 min。將PCR驗證為陽性的轉化子及GS115劃線于MRH平板，觀察其生長情況。將LRA3基因回補菌株命名為GS115-LRA3。

1.2.3GS115、GS115-ΔLRA3及GS115-LRA3菌株生長情況對比 將GS115、GS115-ΔLRA3及GS115-LRA3劃線于MDH、MRH平板，觀察3種菌株在以葡萄糖或鼠李糖為唯一碳源的培養基中的生長情況差異。

1.2.4RNA提取、去帽、環化和反轉錄 挑取GS115單菌落接種于20 mL YPD培養基中，于28℃培養36 h；以1%接種量轉接至100 mL YPR培養基中，于28℃培養36 h，離心收集菌體。

GS115總RNA的提?。翰捎肨rizol法抽提畢赤酵母總RNA。用RNase-free的DNase I消化樣品中的DNA，以通用的5′-AOX和3′-AOX為引物驗證基因組DNA完全去除，PCR體系及程序同程序A，PCR延伸時間為1 min。

RNA去帽：使用RNA 5′焦磷酸水解酶去掉總RNA的帽子結構。反應體系為：10×Thermopol Buffer 5 μL，RNA 8 μL，RppH 5 μL，以RNase-free ddH2O補至50 μL。上下顛倒混勻(或者輕輕吹吸混勻)后，37℃反應2 h，65℃ 5 min終止反應，異丙醇醇沉回收RNA。

RNA環化：使用T4 RNA ligase 1進行RNA環化。反應體系為：10×buffer 2 μL， RNA 500 ng，T4 RNA ligase1 2 μL，RNase抑制劑 1 μL，50% PEG 8000 4 μL，10 mmol/L ATP 3 μL，以RNase-free ddH2O補至20 μL。上下顛倒混勻(或者輕輕吹吸混勻)后16℃溫育12 h，65℃ 5 min終止反應。

RNA反轉錄：用5×All-In-One RT MasterMix進行cDNA反轉錄。反轉錄反應體系為：環化RNA 50 ng，5×All-In-One RT MasterMix 2 μL，以RNase-free ddH2O補至20 μL。反應體系混勻后，25℃退火10 min，42℃反應1 h，85℃ 5 min終止反應。

1.2.5嵌套PCR及轉錄起始位點確定 第一輪PCR反應體系如下：cDNA 100 ng，5×TansStart FastPfu buffer 10 μL，2.5 mmol/L dNTP 6 μL，FastPfu 1 μL，10 μmol/L引物ⅠF/ⅠR(表1)各2.5 μL，以ddH2O補至50 μL。PCR擴增條件為：94℃預變性5 min；94℃變性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸1 min，共28個循環；72℃終延伸10 min。

第二輪PCR反應以第一輪PCR產物為模板，引物為ⅡF/ⅡR(表1)，PCR體系及程序同第一輪PCR。

將第二輪PCR產物連接至pEASY-Blunt載體后轉化E.coliTrans1-T1。以通用引物M13F/M13R進行菌液PCR，PCR體系及程序同嵌套PCR。經1%瓊脂糖凝膠電泳分析鑒定選取較長PCR產物所對應的克隆送至生工生物工程(上海)股份有限公司測序。測序結果使用Vector NIT軟件分析，確定轉錄起始位點。

1.2.6生物信息學分析PLRA3利用啟動子在線分析工具：Promoter Scan(https://www-bimas.cit.nih.gov/molbio/proscan/)、CpGFinder(http://linux1.softberry.com/berry.phtml?group=programs&subgroup=promoter&topic=cpgfinder)、EMBOSS Cpgplot(https://www.ebi.ac.uk/Tools/seqstats/emboss_cpgplot/)和Nsite (http://linux1.softberry.com/berry.phtml?topic=nsite&group=programs&subgroup=promoter)分析預測PLRA3的轉錄起始位點、CpG島及可能的轉錄調控序列。

2 結果與分析

2.1 LRA3基因敲除同源片段的擴增及菌株構建

以GS115基因組為模板進行PCR，分別擴增LRA3基因的上、下游作為敲除同源臂，同源臂長度約為500 bp；以pPICZαA質粒為模板擴增zeocin抗性基因表達盒，片段大小約為1.2 kb。通過重疊延伸PCR將三者連接構建LRA3基因敲除片段(圖1)。

圖1 LRA3基因敲除相關DNA片段Fig.1 DNA fragmentation involved in knocking out LRA3 gene.注：M：8 kb標準Marker；1：敲除片段上游同源臂；2：敲除片段下游同源臂；3：zeocin表達盒；4：LRA3基因敲除片段。

通過電擊轉化將基因敲除片段導入細胞，畢赤酵母的DNA同源重組機制將LRA3基因替換為zeocin抗性表達盒，經Zeocin抗性篩選后再進行基因組水平鑒定(圖2)。敲除菌株通過2套引物進行PCR鑒定，上游引物驗證結果見圖2A，對應菌株的下游引物驗證結果見圖2B。陽性菌株的上游引物擴增片段大小約為1.2 kb，下游約為1.6 kb，故4號為敲除菌株。將陽性轉化子及野生型GS115劃線于MRH平板，發現其幾乎不生長，將LRA3基因敲除酵母菌株命名為GS115-ΔLRA3。

2.2 LRA3基因回補載體及菌株構建

以GS115基因組為模板進行PCR，擴增LRA3基因上、下游基因之間片段，AscⅠ、PacⅠ雙酶切連接至pUCSH載體構建回補載體，PCR驗證陽性克隆大小約為2.2 kb(圖3A)。線性化DNA電擊轉化GS115-ΔLRA3感受態，通過缺乏組氨酸的平板篩選陽性轉化子后進行PCR鑒定(圖3B)。將陽性轉化子及野生型GS115劃線于MRH平板，發現轉化子恢復生長，將LRA3基因回補酵母菌株命名為GS115-LRA3。

2.3 GS115、GS115-ΔLRA3及GS115-LRA3菌株生長情況

將GS115、GS115-ΔLRA3及GS115-LRA3劃線于MDH、MRH平板。當以葡萄糖為碳源時，3種菌株均能正常生長；當以鼠李糖為碳源時，GS115和GS115-LRA3正常生長，而GS115-ΔLRA3未見生長(圖4)，表明LRA3基因參與畢赤酵母鼠李糖代謝過程。

圖2 LRA3基因敲除菌株驗證Fig.2 Verification of LRA3-disrupted strain.注：A：LRA3基因敲除菌株驗證(上游引物)；M：8 kb標準Marker；1：GS115基因組；2：陰性對照；3～8：轉化子。B：LRA3基因敲除菌株驗證(下游引物)；M：8 kb標準Marker；1：GS115基因組；2：陰性對照；3～8：對應轉化子。

圖3 LRA3基因回補載體及菌株驗證Fig.3 Verification of the vector for complementing LRA3 gene and LRA3-complemented strain.注：A：LRA3基因回補載體驗證；M：8 kb標準Marker；1：GS115基因組；2～9：轉化子。B：LRA3基因回補菌株驗證；M：8 kb標準Marker；1：回補質粒；2：GS115基因組；3～9：酵母轉化子。

圖4 3種菌株在不同碳源的生長情況Fig.4 Growth profiles of three strains on different carbon sources.注：左側培養基碳源為葡萄糖，右側為鼠李糖；a、b、c分別為GS115、GS115-ΔLRA3、GS115-LRA3。

2.4 GS115總RNA提取及帽子結構去除

通過CRRT-PCR方法確定PLRA3轉錄起始位點。在以鼠李糖為唯一碳源的培養基中培養GS115，鼠李糖誘導LRA3基因高強度轉錄。收集菌體，以Trizol法抽提GS115中總RNA。電泳結果顯示(圖5A)，總RNA各條帶清晰，未有明顯降解。真核生物基因轉錄時在RNA 5′加帽，促進RNA穩定性。在進行RNA環化前，需要用5′焦磷酸水解酶去除RNA 5′帽子結構(圖5B)。

2.5 P. pastoris GS115總RNA環化及嵌套PCR

RNA經RNA環化酶作用后，轉錄起始位點與RNA 3′多聚腺嘌呤相連而形成環形RNA。根據LRA3的編碼區序列，設計2套PCR引物，引物位置示意圖見圖6A。以環化RNA為模板、以外側引物(ⅠF/ⅠR)進行PCR擴增，PCR產物理論大小約為1 kb。電泳結果顯示，有大小約為1 kb的PCR產物出現(圖6B)。

圖5 RNA提取及去帽處理Fig.5 RNA extraction and decapped RNA.注：A：GS115 RNA；M：8 kb標準Marker；1～2：畢赤酵母GS115 RNA。B：GS115去帽RNA；M：8 kb標準Marker；1：畢赤酵母GS115去帽RNA。

為進一步提高PCR產物的特異性，以第一輪PCR產物為模板、引物為內部引物(ⅡF/ⅡR)進行第二輪PCR。PCR產物理論大小約為0.69 kb，這一結果經瓊脂糖凝膠電泳進一步證實(圖6C)。以上結果表明，利用嵌套PCR可獲得目標片段。

2.6 轉錄起始位點確定

上述嵌套PCR產物連接至克隆載體pEASY-Blunt，通用引物M13F/M13R對轉化子進行PCR驗證(圖7)。由于實驗過程中RNA產生不同程度的降解，導致連接到測序載體的片段大小不一。

選取較大的PCR產物對應的轉化子測序，測序結果使用Vector NIT軟件進行序列比對(圖8)，其中LRA3為LRA3基因的啟動子和編碼區序列，其他序列均為測序所得。CRRT-PCR實驗原理是將mRNA的首尾相連，mRNA的首個堿基即為轉錄起始位點而尾部則是polyA，即polyA后的第一堿基即為啟動子上轉錄起始位點。在本研究中，polyA后面第一個堿基為G。但啟動子上G的前一個堿基亦為A，故這個A是ployA還是轉錄起始位點無法確定。因此，轉錄起始位點可能為A或G。根據大量研究結果統計，轉錄起始位點通常為A[10]，在本研究中認定A為PLRA3的轉錄起始位點。

2.7 PLRA3核心啟動子及核心元件預測

轉錄起始位點(transcription start site，TSS)，通常為轉錄的第一個位點，核心啟動子在TSS指導下發揮正確轉錄起始的作用。核心啟動子一般包括以TSS為中心的上、下游各40個核苷酸，還包含一些重要的核心啟動子元件，典型例如TATA Box、起始子Initiator[11]。當然，不是所有的啟動子都含有所有的核心啟動元件，甚至一些啟動子沒有核心啟動子元件[12]。通過Promoter Scan在線分析PLRA3的核心啟動子及核心啟動子元件(圖9)，預測PLRA3核心啟動子區為-256 bp～-6 bp，得分為69.20，TATA Box位于-32 bp～-36 bp，未預測到其他元件，此結果與之前研究的酵母核心啟動子中唯一的保守基序是TATA Box結論一致[13]。

圖6 CRRT-PCR引物示意圖及嵌套PCR瓊脂糖電泳Fig.6 The schematic diagram of CRRT-PCR primers and agarose gel of nested PCR.注：A：嵌套引物位置示意圖。B：第一輪嵌套PCR產物；M：8 kb標準Marker；1～5號：溫度梯度PCR產物。C：第二輪嵌套PCR產物；M：8 kb標準Marker；1～2：PCR產物。

圖7 PCR鑒定陽性轉化子Fig.7 The PCR identification of transformants.注:M:8 kb標準Marker; 1～12:轉化子。

2.8 PLRA3順式作用元件預測

轉錄因子通過與啟動子區域中的順式元件相互作用，產生不同轉錄效應，基因啟動子含有多種順式作用元件，受到多個途徑的調節[14]。CpG島通常是一段大于200 bp、GC含量不小于50%、同時CpG含量與期望含量的比值不小于0.6的區域[15]。CpG島主要存在于啟動子區，通常情況其為非甲基化狀態，一旦受到調控發生甲基化會抑制轉錄因子結合，最終造成基因沉默[16]。利用CpG Finder和EMBOSS Cpgplot在線分析PLRA3的CpG島存在情況，預測表明PLRA3不存在CpG島，即PLRA3不受甲基化調控。利用Nsite預測PLRA3的順式作用元件，同時結合Promoter Scan結果，將二者重合結果部分列出，具體見表2。

圖8 多序列比對結果Fig.8 The result of multiple sequences alignment.注：灰色陰影區為polyA；字體加粗的A為LRA3基因的轉錄起始位點；黑框為LRA3基因的起始密碼子。

圖9 LRA3基因圖譜及PLRA3啟動子序列Fig.9 The map of the LRA3 gene and the promoter PLRA3 sequence.注：下劃線為核心啟動子；黑框為TATA Box；箭頭指示為轉錄起始位點。

表2 PLRA3順式作用元件預測Table 2 The prediction of cis-acting elements of PLRA3.

3 討論

啟動子是表達系統的關鍵元件之一，在重組蛋白表達中扮演著重要角色。目前，應用于畢赤酵母表達系統的誘導型啟動子可分為天然啟動子和合成啟動子。其中，天然啟動子來源于一些在特定條件下表達譜或轉錄譜波動較大的基因，天然啟動子往往存在一定缺陷，如轉錄強度不足和基礎轉錄高等，需要進行理性改造。在對順式作用元件研究較為清楚的基礎上，可通過控制關鍵順式元件位置、數量和間距構建合成啟動子[19]。Vogl等[20]通過向啟動子最小共有序列摻入常見的轉錄因子結合位點基序構建合成核心啟動子，并在此基礎上添加PAOX1上游序列得到合成啟動子，其在甲醇誘導外源蛋白表達時達到野生型PAOX1核心啟動子的10%。Portela等[21]從頭合成核心啟動子并與畢赤酵母基因AOX1上游調控區融合，其驅動外源蛋白表達水平最高可達野生型PAOX1的70.6%。顯然，合成啟動子是在揭示了天然啟動子上關鍵調控元件的基礎上對天然啟動子進行改良和優化，從而避免天然啟動子存在的一些弊端。

本實驗室挖掘的鼠李糖強誘導型啟動子PLRA3可以實現重組蛋白在畢赤酵母中的高效表達，但表達強度仍有提高的潛力以顯著提高重組蛋白表達水平；該啟動子在無鼠李糖誘導時還有較高的基礎轉錄，重組蛋白存在滲漏表達，在表達對宿主有毒性作用的重組蛋白時效果不夠理想[6～8]。因此，需要揭示該啟動子上關鍵元件以進行理性改良。本研究通過敲除和回補實驗證實了LRA3參與畢赤酵母鼠李糖代謝途徑，并利用CRRT-PCR方法確定了轉錄起始位點A，同時預測了核心啟動子、轉錄重要元件TATA Box及可能的順式作用元件。在后期的研究中，將利用這些信息在啟動子關鍵位點進行突變，從中篩選轉錄強度提升而基礎轉錄強度降低的突變體。