脫落酸拮抗赤霉素抑制水稻地上部生長的研究

戚義東, 秦 華, 高雅迪, 王芳芳, 黃榮峰, 權瑞黨

中國農業科學院生物技術研究所, 北京 100081

ABA在幼苗生長中具有重要作用。研究表明3 μmol/L ABA可以有效地抑制水稻幼苗地上部的生長[1,2]；進一步研究發現，在水稻幼苗期，ABA可以通過調控OsVP1、OsABF1、OsTRAB1、OsEm、OsLEA3和OsWSI18基因的表達，來影響地上部的生長[3]。此外，在脅迫條件(如水淹脅迫)下，ABA可以抑制乙烯的生成，從而影響地上部的生長[4]。ABA信號途徑是在植物脅迫應答中起到核心作用的。在不存在ABA的情況下，2C型蛋白磷酸酶(protein phosphatase-2C，PP2C)能夠使蔗糖非酵解1型相關蛋白激酶2(sucrose non-fermenting 1-related protein kinases 2，SnRK2)去磷酸化而失去活性，從而阻斷ABA信號[5～7]。而在存在ABA的情況下，ABA與受體結合，受體結構發生改變，暴露與PP2C結合的表面，從而促進受體與PP2C的互作，抑制其磷酸酶的活性[8]，進而使SnRK2s從PP2C-SnRK2的復合物中釋放出來，通過自磷酸化作用恢復其激酶活性，激活的SnRK2s能夠磷酸化并激活下游的ABF/AREB轉錄因子，這些轉錄因子能夠調控下游的ABA應答基因，從而激活ABA信號[9～11]。

赤霉素的主要功能是促進水稻莖的伸長，相關機理已經研究得較為清楚。研究表明，赤霉素促進莖的伸長是通過促進細胞的分裂和伸長實現的[12,13]，深入探究其分子機制發現，赤霉素可以提高木葡聚糖內轉糖基酶的活性，編碼該酶的基因為OsXTR1～OsXTR4，其中OsXTR1和OsXTR3在節間伸長中發揮著重要作用[14]；同時，微纖絲的排列方向能夠被赤霉素所改變，排列方向與細胞長軸垂直，促進了細胞的伸長[15]。甲羥戊酸是赤霉素生物合成途徑的初前體，經過雙萜代謝途徑，生成雙萜前體牻牛兒牻牛兒基焦磷酸(geranylgeranyl diphoaphate，GGDP)；GGDP在古巴焦磷酸合成酶(ent-copalyl diphosphate synthase，CPS)的作用下，生成古巴焦磷酸(copalyl pyrophosphate，CPP)；CPP在內根-貝殼杉烯合成酶(ent-kaurene synthase，KS)的作用下，生成內根-貝殼杉烯；內根-貝殼杉烯通過內根-貝殼杉烯氧化酶(ent-kaurene oxidase，KO)經過三步氧化反應生成內根-貝殼杉烯酸；內根-貝殼杉烯酸在內根-貝殼杉烯酸氧化酶(ent-kaurenoic acid oxidase，KAO)的作用下被氧化成GA12。在水稻中，由GA12最終合成赤霉素有2條途徑，一條途徑為C13-非羥基化途徑：GA12-GA15-GA24-GA9-GA4-GA3；另一條途徑為C13-羥基化途徑：GA12-GA5-GA44-GA19-GA20-GA1。參與赤霉素合成途徑的酶可以分為3大類：萜烯合成酶(terpene synthase，TPSs)、細胞色素P450單加氧酶(cytocheome P450 monooxygenases，P450s)和2-酮戊二酸依賴性雙加氧酶(2-oxoglutarate-dependent dioxygen-ases，2ODDs)，其中，TPSs包括CPS和KS，P450s包括KO和KAO，2ODDs包括GA20氧化酶(GA20 oxidase，GA20ox)和GA3氧化酶(GA3 oxidase，GA3ox)[16～18]。有研究報道，赤霉素合成基因下調表達，會導致水稻株高變矮[19]。此外，赤霉素在幼苗期表現為促進水稻地上部的生長，但這方面的報道較少，分子機制也有待進一步研究。

重要糧食作物水稻的產量一直是研究人員密切關注的問題，ABA和赤霉素均能夠影響水稻幼苗地上部的生長，而水稻地上部的生長發育狀況會影響水稻的產量。但二者在調控幼苗生長中的關系尚不清楚。基于此，本研究以水稻野生型Hwayoung(HY)和IR29為研究材料，使用植物激素ABA、GA3和PAC處理，以地上部的長度和鮮重為指標衡量三者對水稻幼苗生長發育的影響。并結合上述赤霉素生物合成途徑和已報道的基因芯片數據[20]，選擇赤霉素合成途徑的關鍵基因OsCPS1、OsKS1、OsKO2、OsKAO、OsGA20ox2和OsSHB為研究對象，采用實時熒光定量PCR技術分析經ABA處理后野生型日本晴中上述基因的表達情況，從而探究ABA和赤霉素在調控幼苗地上部生長中的關系。本文通過研究ABA和GA調控水稻地上部的生長發育的分子機制，以期為農業生產提供提高產量的理論依據。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1實驗材料與主要試劑 水稻野生型日本晴、Hwayoung(HY)和IR29由實驗室保存。Eva Green Mix購于加拿大ABM公司；RNA提取試劑盒購于北京康為世紀生物科技有限公司；反轉錄試劑盒購于南京諾唯贊生物科技有限公司；植物激素ABA、GA3和PAC購于西格瑪奧德里奇(上海)貿易有限公司。

1.1.2實驗儀器 PCR儀(北京東勝創新生物科技有限公司)；PowerPac系列通用電泳儀(美國Bio-Rad公司)；7500實時熒光定量PCR儀(美國應用生物系統公司)。

1.2 實驗方法

1.2.1水稻營養液的配制 水稻營養液分為A液、B液、C液、D液和E液，均為1 000×母液，在使用時按1:1 000的比例加入到水中。A液：NH4NO380 g，NaH2PO4·2H2O 93 g，K2SO452.4 g；B液：CaCl2·2H2O 44.2 g；C液：MgCl2·6H2O 122 g；D液：FeNaEDTA 19 g；E液：H3BO33.01 g，MnSO4·5H2O 2.17 g，CuSO4·5H2O 0.075 g，ZnSO4·7H2O 0.2 g，Na2MnO4·2H2O 0.024 g。分別將上述稱取的藥品，溶解于1 L的蒸餾水中，即為所需的水稻營養液母液。

1.2.2水稻幼苗的培養和處理 水稻種子(HY和IR29)于37℃浸種24 h后，倒掉多余的水分。然后置于37℃繼續培養，每天早晚各換1次水，直至種子露白。挑取萌發一致的種子種到鐵架上，并將鐵架放到塑料盒中，加入6 L水稻營養液(A液、B液、C液、D液和E液各取6 mL，然后加水至6 L，混勻)，再加入ABA、GA3或PAC，對水稻進行植物激素處理,對照組均加入等體積的無水乙醇。基本處理為3組：ABA處理組(1 μmol/L和3 μmol/L)、赤霉素處理組(0.5 μmol/L和3 μmol/L)、PAC處理組(1 μmol/L)；為了進一步探究二者之間的關系，又設置3個處理組：3 μmol/L ABA、0.5 μmol/L GA3、3 μmol/L ABA + 0.5 μmol/L GA3。水稻種子放置在光周期為14 h光照/10 h黑暗的燈光架上，室溫培養，保持液面能夠接觸到種子表面，若液面下降，加水至合適高度。水稻培養6 d后拍照，觀察并記錄表型。同時，使用水稻營養液培養野生型日本晴幼苗，培養方法與上述一致。水稻培養6 d后，加入ABA處理(ABA的終濃度為50 μmol/L)。以加入ABA的時間作為0 h，分別取0 h、1 h、2 h和3 h的水稻葉片用于檢測赤霉素合成基因的表達。

1.2.3水稻生長發育狀況的統計 為了研究水稻地上部的生長發育狀況，統計了2個水稻生長發育指標：地上部長度和地上部鮮重。地上部長度是從葉尖到葉基部的長度。地上部鮮重是取10株鮮活的水稻地上部，用濾紙吸掉表面多余的水分，立即稱重。本研究統計生長發育指標做3次生物學重復實驗，每次重復10株幼苗。

1.2.4提取水稻幼苗的RNA 使用超純RNA提取試劑盒(北京康為世紀生物科技有限公司)提取水稻幼苗的RNA，具體的操作步驟參照試劑盒說明書。

1.2.5水稻cDNA的制備 使用反轉錄試劑盒(諾唯贊生物科技有限公司)制備水稻cDNA，具體的實驗步驟參照試劑盒說明書，制備的水稻cDNA于-20℃保存備用。

1.2.6實時熒光定量PCR 將制備的cDNA上機試模板，若Ct值小于20則說明模板質量較高。本研究使用的熒光染料為SYBR Green，使用的儀器為ABI 7500實時熒光定量PCR儀。qPCR反應體系(20 μL)為：模板1 μL，上、下游引物(引物序列見表1)各1 μL，qPCR Master Mix 10 μL，雙蒸水7 μL。qPCR反應程序為：95℃ 10 min；95℃ 15 s，60℃ 60 s，共40個循環。以水稻中的actin肌動蛋白基因作為qPCR反應的內參，每個樣品做3次平行重復實驗。

表1 赤霉素合成基因qPCR所用引物Table 1 qPCR primers for gibberellin synthesis genes.

1.2.7數據測量、處理和作圖 利用Image J軟件測量水稻幼苗地上部的長度；利用Excel表格對輸入的測量數據進行分析、作圖。

2 結果與分析

2.1 ABA對幼苗地上部生長的影響

ABA是影響水稻生長的重要激素，外源施加ABA可以抑制水稻幼苗地上部的生長[1,2]。為了驗證這一結論，使用1 μmol/L和3 μmol/L的ABA處理HY和IR29，對照組加入等體積的無水乙醇，在室溫條件下生長6 d后，觀察地上部的表型。結果表明ABA可以抑制水稻幼苗地上部的生長(圖1)，具體表現為地上部的長度變短(圖1B)和鮮重減輕(圖1C)。1 μmol/L ABA能抑制地上部的生長，但是抑制作用較弱，而3 μmol/L ABA對地上部的生長有較強的抑制作用。

2.2 赤霉素及其抑制劑對幼苗地上部生長的影響

赤霉素也是影響水稻生長的重要激素，其可促進地上部的生長[19]。為了驗證這一結論，使用0.5 μmol/L和3 μmol/L GA3處理水稻野生型HY和IR29，在室溫下培養6 d后，觀察地上部的表型。如圖2所示，赤霉素可以促進水稻幼苗地上部的生長，且隨著其濃度的升高，對水稻幼苗的地上部的促進作用越明顯，0.5 μmol/L GA3對地上部的促進作用較弱，而3 μmol/L GA3能夠極顯著促進地上部的生長。這種促進作用具體表現在地上部長度的增長(圖2B)和地上部鮮重的增加(圖2C)。

圖1 ABA對幼苗地上部生長的影響Fig.1 Effects of ABA on seedling shoot growth.注：A：經ABA處理后的地上部的表型；B：A圖中的地上部的長度統計柱形圖，統計結果是10株水稻幼苗地上部長度的平均值；C：A圖中的地上部的鮮重統計柱形圖，鮮重是10株幼苗地上部重量的平均值；數據為3次重復實驗的平均值。誤差線表示標準差，3次重復實驗得到相同的結果。不同的小寫字母和大寫字母分別表示同一品種水稻幼苗的不同處理之間差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

圖2 赤霉素對幼苗地上部生長的影響Fig.2 Effects of gibberellic acid on seedling shoot growth.注：A：經GA3處理后的地上部的表型；B：A圖中的地上部的長度統計柱形圖，統計結果是10株水稻幼苗地上部長度的平均值；C：A圖中的地上部的鮮重統計柱形圖，鮮重是10株幼苗地上部重量的平均值；數據為3次重復實驗的平均值。誤差線表示標準差，3次重復實驗得到相同的結果。不同大寫字母表示同一品種水稻幼苗的不同處理之間差異極顯著(P<0.01)。

三唑類植物生長調節劑多效唑(paclobutrazol，PAC)是一個廣譜的赤霉素合成抑制劑，能夠抑制內根-貝殼杉烯酸氧化酶的活性，其可使植物株高變矮，抑制植株的營養生長[21]。本研究使用1 μmol/L PAC處理HY和IR29，與對照組相比，其地上部的長度極顯著縮短(圖3B)，且地上部的鮮重極顯著減輕(圖3C)。這說明，赤霉素合成抑制劑PAC能夠抑制赤霉素的合成，從而抑制地上部的生長。

2.3 赤霉素與ABA對地上部生長的影響

2.1和2.2的研究結果表明，ABA和赤霉素均可影響水稻幼苗地上部的生長。為了進一步探究二者之間的關系，對水稻幼苗進行以下4種處理：對照組、3 μmol/L ABA、0.5 μmol/L GA3、3 μmol/L ABA + 0.5 μmol/L GA3。與對照組相比，3 μmol/L ABA可以顯著抑制幼苗的生長，而同時施加ABA和赤霉素發現ABA對水稻地上部生長的抑制作用顯著減弱(圖4)。以上結果說明，ABA和赤霉素能夠拮抗調控水稻幼苗地上部的生長，并且赤霉素能夠解除ABA對幼苗地上部生長的抑制。

2.4 ABA對赤霉素合成基因表達的影響

從2.3的研究結果可以看出，ABA和赤霉素可以拮抗調控水稻幼苗地上部的生長，而且赤霉素可以解除ABA對幼苗生長的抑制。此外，有研究表明，ABA可以影響赤霉素合成和代謝基因的表達[20]。由此推測，ABA抑制了赤霉素的合成，從而抑制了水稻幼苗地上部的生長。為了驗證這一假設，利用50 μmol/L ABA處理水稻，并分析赤霉素合成基因(OsCPS1、OsKS1、OsKO2、OsKAO、OsGA20ox2和OsSHB)的表達情況。通過qPCR分析發現，OsCPS1、OsKO2和OsSHB基因的表達均出現了先下降后上升的趨勢，且3 h處理組的結果與對照組(0 h)相比，顯著下降或上升但無顯著差異，表明ABA可以不同程度地抑制這3個基因的表達(圖5)。這說明ABA可以抑制赤霉素合成基因的表達，而赤霉素合成的關鍵基因表達量降低之后，會導致內源的活性赤霉素含量降低，從而抑制了幼苗地上部的生長。

圖3 赤霉素合成抑制劑PAC對幼苗地上部生長的影響Fig.3 Effects of gibberellic acid biosynthesis inhibitor PAC on seedling shoot growth.注：A：經PAC處理后的地上部的表型；B：A圖中的地上部的長度統計柱形圖，統計結果是10株水稻幼苗地上部長度的平均值；C：A圖中的地上部的鮮重統計柱形圖，鮮重是10株幼苗地上部重量的平均值；數據為3次重復實驗的平均值。誤差線表示標準差，3次重復實驗得到相同的結果。**和***分別表示同一品種中PAC處理組與對照組相比在P<0.01和P<0.001水平上差異顯著。

圖4 赤霉素與ABA對地上部生長的影響Fig.4 Effects of gibberellic acid and ABA on seeding shoot growth.注：A：4種處理后的地上部的表型；B：A圖中的地上部長度的統計柱形圖，統計結果是10株水稻幼苗地上部長度的平均值；C：A圖中地上部鮮重的統計柱形圖，鮮重是10株幼苗地上部的重量；數據為3次重復實驗的平均值。誤差線表示標準差，3次重復實驗得到相同的結果。不同的小寫字母和大寫字母分別表示同一品種水稻幼苗的不同處理之間差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

圖5 ABA對赤霉素合成基因表達的影響Fig.5 Effects of ABA on expression of gibberellic acid biosynthesis genes.注：A：qPCR分析生長6 d的日本晴幼苗地上部分經50 μmol/L ABA處理后的OsCPS1、OsKS1和OsKO2的基因表達情況；B：qPCR分析生長6 d的日本晴幼苗地上部分經50 μmol/L ABA處理后的OsKAO、OsGA20ox2和OsSHB的基因表達情況。誤差線表示3次生物學重復的標準差。不同的小寫字母和大寫字母分別表示同一基因的不同處理時間之間差異顯著(P<0.05)和差異極顯著(P<0.01)。

3 討論

ABA和赤霉素都是影響水稻生長的重要植物激素，參與到許多的植物生理過程中，其中包括幼苗地上部生長[2,19]。本研究通過地上部的長度和鮮重來衡量ABA、赤霉素和PAC對幼苗(HY和IR29)生長的作用，結果發現ABA和赤霉素拮抗調控水稻幼苗的生長，而且赤霉素可以解除ABA對地上部生長的抑制。為了進一步探究ABA對赤霉素合成基因表達的影響，利用ABA處理野生型日本晴，并通過qPCR檢測了赤霉素合成基因的誘導表達，發現ABA可以抑制赤霉素合成基因的表達。綜上所述，ABA能夠抑制赤霉素合成基因的表達，導致植物體內的活性赤霉素含量降低，從而抑制幼苗地上部的生長。

已有的研究報道主要集中在ABA和赤霉素拮抗調控種子的萌發和休眠[22]，但是ABA和赤霉素協同調控幼苗地上部生長的關系尚不清楚。為了確定調控模式，本研究利用ABA處理的同時外源施加低濃度的GA3，發現解除了ABA對生長的抑制作用。基于上述表型推測，ABA導致了內源的活性赤霉素含量降低，所以抑制了水稻幼苗地上部的生長，而低濃度的GA3彌補了植物體內缺少的活性赤霉素，使其恢復到野生型地上部的長度和鮮重。為了驗證此假設，利用ABA處理已培養6 d的幼苗，qPCR檢測幼苗地上部赤霉素合成基因的表達，研究結果表明ABA可以抑制赤霉素合成基因的表達。

本研究揭示了ABA位于赤霉素生物合成途徑的上游，負調控赤霉素生物合成基因的表達，而后續需要進一步探究的是：赤霉素合成途徑的上游基因。目前的假設是上游基因可能是ABA信號途徑下游的轉錄因子，該轉錄因子可以負調控多個關鍵赤霉素生物合成基因的表達，且直接結合在其中某個基因的啟動子上，直接調控該基因的表達。本研究闡述了在水稻幼苗生長中ABA和赤霉素之間的相互作用機制，為利用ABA信號途徑改良水稻的生長提供了理論依據。