氣孔運動中保衛細胞壁作用的研究進展

周 影, 鄭 林, 魏建華, 馬 艷, 戴紹軍, 王宏芝*

1.東北林業大學鹽堿地生物資源環境研究中心, 東北油田鹽堿植被恢復與重建教育部重點實驗室, 哈爾濱 150000;2.北京市農林科學院北京農業生物技術研究中心, 北京 100097;3.江蘇金陵科技學院, 南京 210038

氣孔是植物葉表皮組織上的小孔，是由兩個保衛細胞圍繞而成的孔隙。氣孔是植物與外界環境氣體交換的門戶，控制水分蒸騰和CO2吸入，在植物生長發育中發揮重要作用。氣孔運動是植物重要生命活動之一，受環境和保衛細胞內部信號轉導以及細胞膨壓控制，通過細胞大小和形狀的改變來實現。紅光和藍光、高濕和低濃度CO2等條件能夠誘導保衛細胞膨壓升高，細胞內溶質快速增加后吸水膨脹、體積增加、形狀改變、氣孔開放；反之，黑暗、高濃度CO2、脫落酸等能夠使保衛細胞膨壓下降、失水收縮、氣孔關閉。在氣孔開放時，保衛細胞的體積可增加40%，細胞內部壓力可達5 MPa, 相當于大氣壓的50倍[1]。保衛細胞形狀改變程度與細胞壁的機械性能密切相關，氣孔正常運動要求保衛細胞的細胞壁不但能承受很高的物理張力，同時具有良好的柔韌性和彈性。

保衛細胞壁屬于初生細胞壁，主要由纖維素、木葡聚糖(一種半纖維素)、果膠和少量結構蛋白組成。根據初生細胞壁模型[2]推測，保衛細胞中纖維素和木葡聚糖組成的網絡結構以及填充其中的果膠多糖基質，是維持保衛細胞壁彈性與強度平衡的基礎。隨著細胞壁相關分子遺傳學、生物化學研究的不斷深入，以及分析模型的引入，人們已開始解析保衛細胞壁的各組成成分及空間分布特性對細胞壁機械性能和氣孔運動功能的影響。本文將討論這一研究領域在分子遺傳學和生物化學研究中的最新成果，重點討論保衛細胞壁不均一特性的最新進展，包括其在氣孔開放運動中的重要作用、進化上的保守性和發育形成過程；并將分別論述保衛細胞壁中纖維素、木葡聚糖、果膠、木質素和細胞壁松弛因子等組分在維持氣孔保衛細胞功能中的作用，同時展望了保衛細胞壁合成及修飾相關分子機制研究的發展方向，以期為保衛細胞壁的遺傳改良提供思路。

1 保衛細胞壁結構組成特性

1.1 保衛細胞壁不均一特性在氣孔運動中的作用

保衛細胞在發育過程中細胞壁沉積和修飾呈非對稱性，形成不均一細胞壁。保衛細胞壁的位置特異性加厚，能夠滿足氣孔開放和關閉對細胞壁不同部位強度、剛性和彈性的差異要求，是保衛細胞不均勻膨脹和氣孔運動中形狀改變的主要決定因素。腎型保衛細胞內壁(腹壁)加厚程度大于外壁(背壁)，富含結晶纖維素，導致保衛細胞內壁的剛性大于外壁，而外壁的彈性大于內壁；啞鈴型保衛細胞的球狀末端壁較薄而中間棒狀部分細胞壁較厚。傳統的觀點認為，保衛細胞外壁和內壁厚度和剛性的差異，使保衛細胞在膨壓作用下外壁彎曲程度大于內壁，導致氣孔開放[3]。但Carter等[4]利用原子力顯微鏡結合模型分析的最新研究表明，保衛細胞端壁特異加厚在氣孔開放運動中起關鍵作用。保衛細胞內壁和外壁厚度和剛性的差異只存在于成熟的保衛細胞中。未成熟保衛細胞雖然沒有這種差異，但同樣能夠響應環境和細胞內部信號而正常開放。進一步研究表明，保衛細胞端壁處的特異性加厚在不同物種中廣泛存在，并且這種加厚在保衛細胞母細胞發育階段即已發生，導致此處細胞壁剛性增強。在氣孔開放運動過程中加厚的端壁限制了保衛細胞復合體的縱向伸長，而改為橫向膨大，保證了氣孔的有效開放。

1.2 保衛細胞不均一細胞壁的進化保守性

盡管從蕨類植物到被子植物的演化過程中，保衛細胞壁組分發生了顯著變化[5]，但細胞壁強度和彈性的不均一分布特性，特別是端壁的特異加厚特性未發生明顯改變[4,6]。蕨類植物中，保衛細胞端壁富含木質素，以增加端壁細胞壁強度; 在被子植物中，端壁中結晶纖維素代替了木質素，此處細胞壁增厚[5]；水生被子植物的基部，由于氣孔一直保持開放狀態，屬于無功能狀態的氣孔，端壁的纖維結晶度較低[7]；而陸生被子植物，除了結晶纖維素外，去甲酯化果膠的參入，進一步提高了端壁強度和剛性[8]。Shtein等[5]考察了6種不同種類植物的3種保衛細胞壁組分，包括蕨類植物的腎型保衛細胞、雙子葉植物的腎型保衛細胞和單子葉植物的啞鈴型保衛細胞，發現纖維結晶度存在3種不同類型。其中雙子葉植物的腎型保衛細胞端壁的纖維結晶度最高，數字化生物機械模式分析顯示此區域是氣孔運動過程中承受張力最大的區域。保衛細胞端壁組分在不同物種之間的差異，推測是進化過程中不同環境選擇壓力的結果[5]。但這種差異并不影響保衛細胞壁強度和彈性的不均一分布特性以及氣孔功能，二者在進化中均十分保守。

1.3 保衛細胞不均一細胞壁的發育形成過程

保衛細胞壁不均一加厚，自保衛細胞母細胞分裂前即已開始。以雙子葉植物腎型保衛細胞發育為例，細胞壁經過一系列非對稱沉積和修飾，最終發育成具有功能的保衛細胞(圖1)。首先，在對稱分裂發生前，保衛細胞母細胞端壁加厚，之后細胞以垂直于加厚端壁的方向發生分裂(圖1A)[9]。新形成的細胞壁富含胼胝質和果膠，附近聚集微管束。隨后胼胝質和果膠降解(圖1B)，兩個保衛細胞內壁分離，形成孔狀結構(圖1C和1D)。胼胝質合成和降解[10]以及果膠降解[11]的精細時空特異性調控對正常孔狀結構形成具有重要作用，盡管其中分子調控機制尚不清楚。成熟保衛細胞位于孔狀結構處的內壁主要由結晶纖維素組成，細胞壁明顯增厚，彈性下降，強度和剛性增加。同時，極性端壁及兩個保衛細胞連接處細胞壁亦明顯增厚，富含結晶纖維素和去甲酯化果膠，細胞壁強度和剛性明顯提高(圖1D)[4]。

圖1 保衛細胞壁分化過程中形成非對稱性細胞壁[8]Fig.1 The asymmetric accumulation and modification of cell walls in stomatal differentiation[8].A：保衛細胞母細胞端壁出現纖維素加厚，細胞以垂直于加厚端壁方向發生對稱分裂；B：新生細胞壁在特定部位發生胼胝質和果膠降解；C：兩個保衛細胞內壁分離，形成孔狀結構；D：成熟保衛細胞，內壁大量沉積結晶纖維素，細胞壁較外壁明顯增厚；兩個細胞連接處細胞壁及端壁亦明顯增厚，富含去甲酯化果膠。

2 保衛細胞壁組分對氣孔運動功能的影響

隨著植物基因組計劃的廣泛開展和基因功能研究的深入，細胞壁組分影響保衛細胞壁機械性能和氣孔運動的分子遺傳學證據不斷涌現。這些研究成果為保衛細胞壁的分子遺傳改良提供了可能性。

2.1 纖維素和木葡聚糖對氣孔運動功能的影響

Rui等[12,13]通過圖像分析結合計算機械模型，對擬南芥纖維素和木葡聚糖突變體進行詳細分析，從遺傳學角度證明了纖維素和木葡聚糖與保衛細胞壁機械特性及氣孔功能密切相關。擬南芥纖維素合成酶CesA3的突變體分析表明，保衛細胞壁纖維素含量與氣孔開度密切相關。纖維素含量降低導致氣孔響應外界條件信號的開關功能異常，氣孔開度增加；突變體互補實驗顯示，當突變體纖維素含量恢復正常后，氣孔開度亦恢復正常。木葡聚糖缺失突變體(xxt1xxt2)，由于木葡聚糖含量降低，氣孔開度減小，葉片表面溫度升高。分析表明，木葡聚糖通過調節氣孔縱向的收縮和擴張，調節氣孔大小。纖維素和木葡聚糖參與氣孔運動還體現在氣孔運動過程中纖維素微纖絲發生的重新排列。氣孔開放時纖維素微纖絲相對均勻地分布在細胞壁上，氣孔關閉時，微纖絲成束存在。氣孔運動過程中纖維素微纖絲的這種重新排列，即細胞壁結構改變需要木葡聚糖協助完成。木葡聚糖可以直接和纖維素結晶區交聯，增加細胞壁的承重和抗張性[14]。盡管保衛細胞壁中纖維素和木葡聚糖缺失對氣孔開度影響結果不同，但研究者認為纖維素和木葡聚糖缺失均會導致細胞壁強度和剛性增強[15]。

2.2 果膠對氣孔運動功能的影響

保衛細胞壁中富含果膠，生物化學相關研究結果表明細胞壁果膠與氣孔功能密切相關。早在1985年，Wu等[16]推測細胞壁中果膠基質多糖參與保衛細胞壁徑向延伸。苔蘚植物作為最早出現氣孔的植物，氣孔只在孢蒴膨大過程的短暫生長期能夠開關，其后即失去開關能力。膠體金免疫標記技術研究表明，苔蘚植物保衛細胞發育過程中細胞壁中果膠含量呈下降趨勢，推測果膠含量下降與氣孔失去運動能力有關[17]。Jones和Milne[18]使用聚阿拉伯糖內切酶處理植物表皮，解離聚鼠李糖半乳糖醛酸Ⅰ型果膠的阿拉伯糖側鏈之后，使用殼梭包桿菌素誘導氣孔開放或者脫落酸誘導氣孔關閉，發現相應的氣孔運動受到限制。進一步分析表明果膠中阿拉伯聚糖側鏈決定保衛細胞壁彈性，進而影響氣孔開關。

果膠甲酯化程度影響氣孔功能。果膠多糖在高爾基體中合成，之后以高度甲酯化形式分泌到胞外。在細胞壁上沉積后，由果膠甲酯酶(pectin methylestrases，PME)選擇性切除甲基基團。推測果膠去甲酯過程具有時空特異性。有關果膠甲酯化程度影響保衛細胞壁機械性能和氣孔運動的最早的遺傳學證據來源于Amsbury等[19]的研究成果。擬南芥果膠甲酯酶基因PME6突變后，細胞壁中去甲酯化果膠含量下降，氣孔開放及關閉潛力下降，導致在高濃度CO2環境中，突變體氣孔關閉不嚴，而在低濃度CO2環境中，氣孔開放程度小于對照。推測保衛細胞中去甲酯化果膠含量減少導致細胞壁彈性下降。Huang等[20]利用擬南芥突變體證明果膠甲酯酶基因PME34參與保衛細胞熱激響應。正常條件下，植物能夠響應熱激脅迫，改變氣孔開度和蒸騰效率，以降低葉片表面溫度和調節水分利用效率。PME34基因突變后，擬南芥響應熱激能力喪失。此外，研究表明多聚半乳糖醛酸酶(一種果膠水解酶)參與氣孔運動[11]，而果膠甲酯酶可以通過提高果膠多聚半乳糖醛酸酶活性，進一步緩解脅迫對細胞壁造成的傷害[21]。推測果膠甲酯酶和多聚半乳糖醛酸酶在氣孔運動過程中可以調節果膠分子的動態變化，其活性受植物生長發育和環境信號嚴格調控。

2.3 木質素在氣孔運動中的作用

雖然木質素主要存在于次生細胞壁中，但保衛細胞壁中仍可檢測到少量木質素。木質素是否與氣孔功能有關，目前尚不清楚。蕨類植物保衛細胞端壁富含木質素，以增加細胞壁強度和剛性；被子植物只在保衛細胞內壁中能夠檢測到少量木質素[5]。擬南芥R2R3-MYB轉錄因子AtMYB61[22]及其楊樹同源基因PtoMYB170[23]參與木質素合成調控。過量表達AtMYB61和PtoMYB170導致木質素沉積增強，次生細胞壁增厚。除了在維管組織中高水平表達外，這兩個基因均在保衛細胞中高水平表達，過量表達導致氣孔開度減小，而突變體氣孔開度增加。擬南芥突變體中詳細分析顯示AtMYB61參與黑暗誘導的氣孔關閉，而且這一過程獨立于ABA和空氣濕度誘導的氣孔關閉途徑。推測AtMYB61表達水平變化影響了保衛細胞壁特性，進而影響了氣孔開度[22]。由于AtMYB61參與果膠沉積調控[24]，所以AtMYB61突變體氣孔開度改變是否與保衛細胞壁木質素沉積改變有關尚有待進一步研究。

2.4 細胞壁松弛因子對氣孔運動功能的影響

氣孔開放和關閉運動過程中，細胞壁纖維素微纖絲發生重新排列[13]。推測這一過程中纖維素微纖絲與交聯的木葡聚糖間的氫鍵發生斷裂，木葡聚糖分子斷裂并重新連接，細胞壁松弛，在此基礎上纖維素微纖絲發生滑動，促進保衛細胞在膨壓作用下膨脹和收縮。已報告的細胞壁松弛因子主要包括膨脹素(expansin)蛋白、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase (XET)/hydrolase，XTH)、糖基水解酶(glycosidehydrolase, GH)和羥基自由基(hydroxyl radical,·OH)[25]。目前有關細胞壁松弛因子參與氣孔運動的研究有待深入，只有少數有關膨脹素蛋白、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶參與氣孔運動的初步遺傳學報道。

2.4.1膨脹素蛋白與氣孔運動功能 膨脹素蛋白，也稱擴展蛋白，是一類能夠使細胞壁松弛的細胞壁活性蛋白[26]。膨脹素蛋白通過一種非酶機制，打斷纖維素微纖絲和細胞壁基質多糖的非共價連接，導致植物細胞壁中纖維素微纖絲滑動，促進細胞壁在膨壓作用下蠕動[27]。擬南芥細胞壁膨脹素蛋白EXPA1在保衛細胞特異表達，過量表達增加轉基因株系在光誘導條件下的氣孔開度；抑制該蛋白活性，降低了氣孔對光刺激的敏感性[28]。推測細胞壁膨脹素蛋白通過改變保衛細胞壁的松弛性來調節氣孔開放。

2.4.2木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶與氣孔運動功能 木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶(xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase, XTH)是植物細胞壁結構改變的關鍵酶，松弛細胞壁能夠催化木葡聚糖分子水解與再連接，通過一種“分子嫁接”的機制介導細胞壁的結構改變和松弛[29]。研究者在西紅柿中過量表達辣椒XTH3基因，干旱脅迫下轉基因西紅柿氣孔關閉比例增加，干旱忍受能力增強。推測氣孔關閉與XTH3基因過量表達引起的細胞壁結構改變有關[30]。

3 展望

氣孔是植物與外界環境氣體交換的門戶，對全球碳和水分循環具有重要影響。氣孔開放是植物的重要生命活動之一，與植物水利用效率和農業生產效率密切相關[31]。氣孔在降低葉片溫度和代謝流以及信號長距離運輸轉導中發揮重要作用[32～34]。有效調控氣孔開關，提高植物光合效率和水資源利用效率，在全球氣候變暖和水資源危機干旱持續發生的今天顯得尤為重要。深入解析保衛細胞壁影響氣孔運動的分子遺傳機制，將為保衛細胞壁遺傳改良和創制耐干旱植物提供新的策略。

盡管大量的遺傳學研究已表明保衛細胞壁組成和空間分布特性影響氣孔功能，但調控保衛細胞壁合成、修飾和特異沉積的上游轉錄調控因子和信號轉導途徑，以及這一過程對環境的響應知之甚少。轉錄調節在植物生長發育和響應環境信號過程中發揮重要作用。次生細胞壁合成調控研究表明，轉錄調控是次生細胞壁合成調控的核心，由眾多轉錄因子共同參與，形成復雜的分級調控網絡，協同調控細胞壁各組分的合成。因此，挖掘保衛細胞壁合成調控關鍵轉錄因子，將有助于闡明保衛細胞壁參與氣孔運動調節和環境響應的分子機制及調控網絡。由于氣孔的開放和關閉，明顯影響葉片表面溫度，而葉片表面溫度可以通過紅外相機鑒定。利用這種方法，可以快速鑒定氣孔突變體，挖掘影響氣孔功能的轉錄因子。此外，隨著植物轉錄組和基因組計劃的廣泛開展，根據基因特異表達模式，利用反向遺傳學方法，同樣可以挖掘潛在的候選基因。

有關保衛細胞壁參與氣孔運動的另一個基本問題是：在氣孔運動過程中，保衛細胞壁基質多糖(木葡聚糖和果膠多糖)的動態變化和重構是如何進行的？盡管我們對氣孔運動過程中保衛細胞壁動態變化知之甚少，但現有的知識提示我們細胞壁果膠分子修飾相關酶類及細胞壁松弛因子可能參與氣孔運動過程中保衛細胞壁的重構。可以利用反向遺傳學方法，對保衛細胞中特異表達的果膠甲酯酶、果膠乙酰化酶、膨脹素蛋白、木葡聚糖內轉糖苷酶/水解酶等基因進行功能鑒定。