組學在花藥發育研究中的應用進展Ⅰ:轉錄組學

張在寶, 趙 海, 胡夢輝, 鄧麗君, 王 琦, 李九麗, 袁紅雨,2

1.信陽師范學院生命科學學院, 河南 信陽 464000;2.信陽師范學院, 河南省茶學重點實驗室, 河南 信陽 464000

開花植物中，花藥不僅為花粉的產生、發育及成熟提供了適宜的環境，并且花藥發育過程是直接決定植物育性的關鍵所在。因此研究植物的花藥發育，進一步解析植物的生殖發育調控網絡，對于提高植物的抗逆能力、闡明植物雄性不育機制、培育新的作物品種以及最終提高糧食產量具有重要的理論意義與經濟價值。

當前，在花藥中單純研究某個基因或單一生物分子的變化，已經很難滿足系統生物學越來越高的研究期望。因此，綜合多組學數據，從基因、轉錄、蛋白和代謝水平全面深入地對生物過程進行闡釋以更好地對生物系統進行全面了解已成為研究的熱點。組學研究是隨著系統生物學的發展迅速發展起來的，它的運用為系統生物學提供了大量的實驗數據和先進的技術方法，并且為系統生物學的發展提供了新穎的研究思路，加速了系統生物學的發展。

近年來，以轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學為代表的組學分析方法正逐步在植物花藥發育的研究上應用，取得了很多突破性的研究成果。本系列文章較全面地介紹了轉錄組學、蛋白質組學和代謝組學[1]在植物花藥和花粉發育、雄性不育和逆境脅迫中的研究成果，以及在非編碼RNA中的研究進展，總結和評述了組學整合分析的發展趨勢,以期為花藥發育相關研究提供參考。

轉錄組學的概念由 Velculescu等[2]首先提出，指某一特定生理條件下從RNA水平研究基因表達的情況，即生物樣本內全部轉錄本的RNA序列的測序，是研究基因功能和細胞表型的一個重要手段。目前研究轉錄組學的主要研究方法有：表達序列標簽、基因表達序列分析、基因芯片、cDNA-AFLP、高通量測序、逆轉錄PCR、實時熒光定量PCR、生物信息學等。在花藥中進行轉錄組學研究有利于闡明花藥發育過程中發生的生物過程的潛在機制，本文主要闡述了轉錄組學在植物花藥發育研究中的應用進展。

1 轉錄組學在研究花藥發育功能基因方面的應用

前人在花藥發育關鍵基因上的認識主要是通過功能基因敲除、誘變或RNA干擾技術收集的信息[2]。在擬南芥中，許多對花藥發育至關重要的基因已被闡明。在擬南芥花藥發育的早期階段，SPL和EMS1發揮著重要作用[3～10]，SPOROCYTELESS(SPL)/NOZZLE和ROX參與孢原細胞分化[3,4,11]，AtMYB103、DYT1、TDF1、AMS和MS1在絨氈層發育和細胞程序性死亡中起重要作用[5～9]。此外，ems1轉錄組的變化表明細胞和細胞的信號傳導能夠顯著影響絨氈層中的轉錄調控網絡[12]。目前通過微陣列和序列合成技術已經在許多植物中分析了花藥轉錄組。比如使用比較轉錄組學方法鑒定了170個小麥基因，用于花藥和花粉發育、花粉和雌蕊相互作用等的研究，結果發現小麥近三分之一的基因組經歷了亞基因組分化，在鑒定出的基因中，那些參與編碼脂質代謝途徑的酶基因占最大類別，表明脂質代謝在小麥生殖發育中比較重要和特殊[13]。Ma等[14]通過分析擬南芥小孢子敗育的不育突變體(ams)早期花藥的轉錄組譜發現，與野生型花藥相比，1 368個基因在ams中差異表達，這影響到了代謝、運輸、泛素化和應激反應。此外，他們還將ams轉錄組譜與其他兩種不育突變體，spl/nzz和ems1/exs的序列組合，顯示至少一種突變體中有3 058個基因的表達發生改變。ams花藥轉錄組的分析及其與spl/nzz和ems1/exs花藥的比較揭示了重疊和不同的受調控基因組，包括編碼轉錄因子和其他蛋白質的基因。Feng等[15]對dyt1和野生型花藥的比較轉錄組分析表明，dyt1是正常表達途徑所必需的，包括脂質代謝和轉運、花粉層形成、細胞壁修飾、木質素和類黃酮生物合成以及轉運。已有的研究表明dyt1與絨氈層功能以及減數分裂和花粉形成的進程緊密相關[16,17]。另外，他們通過轉錄組分析表明dyt1可能作為精確控制絨氈層功能的轉錄調控網絡中的樞紐。此外，許多基因也在水稻中被鑒定和表征，揭示了基因功能的差異或新的基因功能。Deveshwar等[2]對水稻花藥發育的四個階段，即減數分裂前、減數分裂、單細胞花藥和三核花粉進行轉錄組綜合分析，發現在至少一個花藥發育階段中表達的22 000個基因中，減數分裂時期數量最多，在三核花粉時期數量最低。此外，他們通過基因本體論和階段特異性基因分析揭示了那些編碼轉錄因子和蛋白質折疊、分選和降解途徑的基因在減數分裂中占主導地位，而在三核花粉中，編碼細胞結構和信號轉導的基因比較豐富。

成熟花粉的發育和釋放取決于花藥的營養細胞層和生殖細胞層中諸多基因的精細協調，花粉的大規模轉錄組分析研究有助于表征植物花粉發育過程中的基因表達譜[18]。在水稻中，使用44K水稻寡核苷酸微陣列平臺和57K水稻基因組陣列，通過激光顯微切割絨氈層，小孢子和花粉來研究發育中花粉的轉錄組，發現水稻中花粉優先產生或階段特異性轉錄物的“U型”變化，其中在雙細胞階段優先表達的基因數量最少[19](表1)。研究人員使用擬南芥8K基因芯片研究了擬南芥成熟花粉的轉錄組，他們分別在成熟花粉中鑒定了992個和1 587個差異表達的基因，估計擬南芥中花粉表達基因的總數在3 500～5 500之間[21,30]。Li等[18]通過對油菜花藥發育過程進行全轉錄組分析，發現脂質和碳水化合物代謝在整個花藥發育過程中比較活躍；早期花藥優先表達參與脂質代謝的基因，這與花粉形成以及胚細胞和胞質體生物合成相關，而晚期花藥表達與碳水化合物代謝相關的基因以形成花粉并在成熟花粉粒中積累淀粉，這揭示了花藥發育過程中早期和晚期花藥發育階段之間基因表達的動態變化。

表1 轉錄組學在花藥發育研究中的應用Table 1 Application of transcriptomics in anther development research.

2 轉錄組學在挖掘花藥抗逆基因方面的應用

高溫對植物的生殖發育有很大的影響。在對熱應激的擬南芥研究中，觀察到營養生殖組織中不同的反應模式，在高溫脅迫下，數百個基因在花組織中被特異性的上調或下調[22](表1)。Gonzalez-Schain等[23]對N22品種水稻開花期間熱處理和對照處理的生殖組織進行RNA測序，揭示了許多編碼轉錄因子家族的基因，以及信號轉導和代謝途徑基因的表達被抑制。另一方面還發現編碼熱激因子的基因被高度激活，而且許多基因主要在花藥發育的后期階段表達。

在低溫敏感小麥品種的冷處理早期，對小孢子胚胎發育時期的轉錄變化和調節的研究中確定了大量推定的轉錄物，這些轉錄物可能是誘導小孢子胚胎發生的特定基因，Honys等[20]首次了解了小RNA在小孢子重編程中對胚胎細胞命運的調節作用(表1)。水稻生殖階段的低溫脅迫通常會導致花藥發育異常，造成小穗育性降低和產量下降。之前僅在幼苗期使用水稻葉片進行水稻冷響應的轉錄組研究，忽略了對冷更敏感的孕穗期，更忽略了與產量高度相關的生殖器官，如花藥。鑒于該階段在水稻栽培中的重要意義，研究孕穗期耐低溫遺傳機制勢在必行。Bai等[24]使用RNA-Seq分析來研究冷處理后生育敏感階段兩種不同光溫敏雄性不育水稻花藥的轉錄組，鑒定了差異表達的基因，例如轉錄因子、信號轉導組分和參與代謝的基因，擴展了對植物冷應激反應的理解。此外，與DNA復制和核糖體相關的差異表達基因也在已有研究中得到了很大程度的豐富，這意味著這些過程可能在水稻花藥對冷脅迫的反應中起重要作用(表1)。

3 轉錄組學在解析雄性不育分子機制方面的應用

雄性不育是開花植物中普遍存在的一個現象，其特征在于植物不能產生正常功能的雄配子，但雌蕊仍具有接受來自其他正常植物的可育花粉并產生種子的能力[31]。導致雄性不育的原因很多，如低溫、高溫、干旱、重金屬、鹽度等非生物脅迫會導致花藥中很多蛋白質發生變化，進而造成雄性不育[32]。雄性不育是對植物進行遺傳改良和利用作物雜種優勢進行優化生產的重要工具，也是探索花藥和花粉發育生物學中細胞質機制和逆轉信號通路的經典模型。

現有的測序技術，已經產生了高質量的水稻、擬南芥和玉米的花藥孢子體轉錄組。這些轉錄組數據有助于在不同領域進行研究，包括發育基因活動網絡、酶和代謝域的變化，通過數量調節、分泌調節、反義轉錄物調節和小RNA預測蛋白質功能，促進了雄性不育的研究[33]。Qu等[25]通過檢測油菜雄性不育系WSLA和雄性可育系WSLB，發現差異表達的基因中有很大一部分涉及與開花相關的生物過程，包括花粉管萌發和生長、花粉壁組裝和修飾，以及花粉外壁形成和授粉。此外，與孢粉質積累相關的一部分基因在WSLA中均上調表達，過量的孢粉素導致花粉壁形成缺陷，這導致WSLA雄性不育(表1)。Yang等[27]在棉花細胞質雄性不育研究中鑒定了大量具有生物學意義的差異表達基因，特別是與光合作用、氧化還原反應、α-亞麻酸代謝和類黃酮生物合成有關的基因。

4 在尋找調控類非編碼RNA方面的應用

非編碼RNA(ncRNA)是一類廣泛存在于植物、不編碼蛋白質的RNA分子。植物中的ncRNA主要由小ncRNA和長鏈非編碼RNA(lncRNA)組成，小ncRNA包括miRNA(microRNA)和siRNA(small interfering RNA)。它們直接以RNA分子的形式存在于植物體內，具有重要的調節功能，并參與細胞分化和個體發育等生理過程。研究植物的ncRNA可以為深入了解植物的生長發育及系統進化提供重要信息。

植物miRNA是20～24個核苷酸的非編碼小RNA，它通過轉錄后降解或抑制翻譯來調控靶基因的表達[34]。許多研究表明，miRNA在植物花藥發育過程中發揮著重要作用，miRNA已在許多作物中被鑒定和表征。在芥菜中已經鑒定了細胞質雄性不育(cytoplasmic male sterility, CMS)和保持系之間47個差異表達的miRNA，這些miRNA可能參與花藥發育過程中與CMS發生有關的調控途徑[28]。在甘藍型油菜中，參與花粉發育的54個保守的和8個新的miRNA家族被鑒定[26](表1)。在蘿卜花藥中也鑒定出162種已知的miRNA，其中分別發現28種已知的miRNAs和14種潛在的miRNAs在CMS和保持系之間的進一步發育過程中差異表達[29]。在陸地棉中，16個保守miRNA家族中的6個在花藥發育過程中細胞核雄性不育(genic male sterility, GMS)突變體和野生型之間顯示出明顯的表達差異[35]。Zhang等[36]對三系雜交棉系統減數分裂階段的花蕾進行小RNA和轉錄組測序聯合分析，發現許多miRNA(DEMs)及其靶基因差異表達，進一步分析顯示這可能與CMS和育性恢復有關。另外，對玉米fzt突變體中的雄性不育缺陷個體進行分析，結果表明在玉米花藥成熟的最后階段必須有miRNA的存在，并且花藥壁缺陷表明miRNA在花藥發育早期可能具有關鍵的調控作用[37]。

另外，長鏈非編碼RNA(lncRNAs)是指長度大于200個核苷酸、缺少編碼蛋白質功能的RNA。目前已經有一些研究報道了在花藥發育過程中起調控作用的lncRNAs，例如玉米Zm401是一種主要在花藥絨氈層和小孢子中表達的花粉特異性lncRNA，Zm401表達水平顯著影響MZm3-3、ZmC5和ZmMADS2的表達，這對于花藥發育十分重要；Zm401沉默后導致MZm3-3上調，以及ZmMADS2和ZmC5下調，并造成絨氈層功能和小孢子發育異常，最終導致植物雄性不育[38]。此外在大白菜花粉發育中具有重要功能的BcMF11，是一種含有828個核苷酸的lncRNA。BcMF11在花粉發育的許多階段轉錄，當降低其表達時，絨氈層降解會延遲，同時也導致小孢子分離和花粉粒發育中止[39,40]。在水稻中鑒定了一種與長日特異性雄性不育相關的lncRNA(LDMAR)，在長日照條件下，正常花粉發育需要足夠的LDMAR轉錄物表達，LDMAR的突變沉默會導致發育中的花藥細胞過早地程序性死亡，從而造成植物光敏感雄性不育[41]。

綜上所述，轉錄組學在花藥發育功能研究、抗逆基因篩選、雄性不育機制探究乃至表觀遺傳(調控類非編碼RNA)解析等方面發揮廣泛而重要的作用。除了對不同發育階段的花藥器官或組織進行轉錄譜分析外，針對某一特定花藥發育關鍵基因的突變體的轉錄組分析策略得到廣泛地應用，這對深入探究花藥發育的網絡調控機制具有顯著的促進作用；花藥是植物對環境脅迫最敏感的器官之一，利用轉錄組分析技術挖掘抗逆基因很早就已得到應用，某些抗逆關鍵基因的挖掘和應用，無疑將極大地推動農作物的遺傳改良和觀賞植物的推廣種植；雄性不育是作物育種的主要材料來源之一，其與轉錄組學技術的結合是探究雄性不育背后的分子機制的關鍵手段；非編碼RNA的調控作用是生物的表觀遺傳現象之一，盡管目前已經鑒定了一些非編碼RNA參與調控某些花藥基因的表達，但是還有極其多的調控類非編碼RNA未得到鑒定，大規模轉錄組學的應用在一定程度上緩解了這個問題。

5 展望

技術的誕生和創新源于應用的需求。自從第二代測序技術問世以來，測序技術的發展可謂日新月異。目前，由于基因組和轉錄組數據所展現的混合細胞群體的限制，人們已經開始探索并應用單細胞測序技術來研究單一或單種細胞的基因和表達信息。2019年中國科技協會在科協年會上發布了20個前沿科學問題和工程技術難題，其中就有“單細胞多組學技術”。世界上沒有兩片完全一樣的葉子，同理，世界上也沒有兩個完全一樣的細胞，即使在同一個組織中剛剛經有絲分裂產生的兩個子細胞之間也是如此。就花藥發育而言，花藥從外到內分別由外表皮、內表皮、中間層、絨氈層和生殖細胞組成，每種細胞都有其特定的起源、分化和功能。先前的研究主要是利用某基因的組織表達模式來推斷某細胞群在花藥發育中的功能，未來單細胞基因組和轉錄組技術的應用將極大地促進各類型細胞功能的精確鑒定，另外其在各類型細胞起源的追溯和花藥器官的重建方面也具有非常重要的應用潛力。