PTTG、VEGF-C表達(dá)水平對宮頸鱗癌淋巴管生成及預(yù)后的影響

王仕海

宮頸癌是最常見的婦科惡性腫瘤之一，隨著環(huán)境污染的加劇和不良性生活的增加，其發(fā)病年齡逐漸年輕化。現(xiàn)代流行病學(xué)顯示宮頸癌與人類乳頭瘤病毒（Human papillomavirus，HPV）感染、性行為、生育次數(shù)、性傳播疾病等因素有關(guān)[1]。宮頸癌早期無明顯的臨床癥狀和體征，容易漏診或誤診，嚴(yán)重危害女性身心健康，加大力度開發(fā)新型腫瘤標(biāo)記物，對于宮頸癌的治療有重大意義[2]。研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力與患者預(yù)后密切相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移能力主要通過淋巴血管實(shí)現(xiàn)，其生成機(jī)制尚不明確[3]。據(jù)報(bào)道垂體瘤轉(zhuǎn)化基因（Pituitary tumor-transforming gene，PTTG）和其反式激活靶基因血管內(nèi)皮生長因子-C（Vascular endothelial growth factor-C，VEGF-C）參與腫瘤淋巴管生成過程，在易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的實(shí)體瘤如肺癌、胃癌等中異常高表達(dá)，但其表達(dá)與宮頸鱗癌淋巴管生成的關(guān)系研究較少[4，5]。本研究旨在探討PTTG、VEGF-C表達(dá)水平對宮頸鱗癌淋巴管生成和預(yù)后的影響。

1 材料與方法

1.1 一般資料收集2013年8月～2015年5月入院治療的宮頸鱗癌患者術(shù)后宮頸癌標(biāo)本56例（宮頸癌組），慢性宮頸炎患者組織標(biāo)本15例（炎癥組），分別經(jīng)病理學(xué)檢測確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌和慢性宮頸炎。宮頸癌患者年齡29～65歲，平均（45.32±7.82）歲；腫瘤大小：≤3cm 38例，＞3cm 18例；FIGO 分期：Ⅰ期27例，Ⅱ期20例，Ⅲ期9例；腫瘤分化程度：低分化27例，中-高分化29例；淋巴浸潤情況：淋巴浸潤37例，無淋巴浸潤19例；淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況：轉(zhuǎn)移30例，無轉(zhuǎn)移26例。炎癥組患者年齡32～68歲，平均（46.15±8.29）歲，兩組患者年齡比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），具有可比性。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn)與排除標(biāo)準(zhǔn)納入標(biāo)準(zhǔn)：宮頸癌標(biāo)本和慢性宮頸炎患者組織標(biāo)本經(jīng)病理學(xué)檢測確診為宮頸鱗狀細(xì)胞癌和慢性宮頸炎[6]；患者年齡≥18歲；臨床資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：其他類型宮頸癌；心、肝、腎等重要器官功能障礙；合并其他惡性腫瘤；妊娠、哺乳期婦女；嚴(yán)重感染；先天性免疫疾病；血液系統(tǒng)疾病；近期接受放化療。

1.3 免疫組化檢測組織中PTTG、VEGF-C表達(dá)于液氮罐中取出石蠟切片標(biāo)本，高溫烘烤脫蠟后酒精梯度脫水，滴加3%H2O2處理10min，PBS沖洗3次；于檸檬酸緩沖液中微波加熱10min，修復(fù)抗原，冷卻后PBS沖洗3次；孵育PTTG、VEGF-C及D2-40一抗（美國Sigma-Aldrich公司，PTTG：SAB1 409992，VEGF-C：SAB1303607，D2-40：SAB140 6699，稀釋比例均為 1∶100），PBS作陰性對照，4℃條件下過夜，PBS沖洗3次；孵育二抗-HRP多聚體，37℃條件下20min，PBS沖洗3次；滴加DAB顯色5～15min，充分水洗終止顯色；蘇木素襯染，充分水洗，酒精梯度脫水后二甲苯透明，采用中性光學(xué)樹脂封片，于顯微鏡下觀察。

免疫組化結(jié)果判斷：PTTG、VEGF-C、D2-40染色分別定位于胞漿、胞漿和細(xì)胞膜、淋巴管內(nèi)皮細(xì)胞，表現(xiàn)為棕黃色顆粒，顯微鏡下隨機(jī)選5個(gè)視野，根據(jù)染色情況判斷其表達(dá)，無染色或染色細(xì)胞百分比＜10%判定為陰性，染色細(xì)胞百分比≥10%判定為陽性，評判過程由兩名資深病理科醫(yī)師獨(dú)立進(jìn)行，并共同商定最終結(jié)果[7]。

1.4組織中淋巴管密度檢測利用D2-40單克隆抗體標(biāo)記宮頸癌組織中的微淋巴管，首先在低倍鏡下選擇4個(gè)微淋巴管高密度區(qū)，然后在400倍鏡下（0.16mm2/視野）隨機(jī)挑選4個(gè)視野計(jì)數(shù)（支/mm2），最終取平均值；視野中含有平滑肌或內(nèi)皮細(xì)胞的管腔數(shù)大于8個(gè)及未著色的管腔不計(jì)數(shù)[8]。

1.5 隨訪隨訪至2018年6月1日，共36個(gè)月，通過門診、電話等形式進(jìn)行隨訪，記錄宮頸癌患者無進(jìn)展生存期（Progression-free survival，PFS）和總生存期（Overall survival，OS），PFS 是指腫瘤疾病患者從接受治療開始，至觀察到疾病進(jìn)展或者發(fā)生因?yàn)槿魏卧蛩劳龅臅r(shí)間，OS是指腫瘤疾病患者從接受治療開始，至任何原因死亡的時(shí)間；隨訪頻率：術(shù)后第1年1個(gè)月隨訪1次，術(shù)后第2年3個(gè)月隨訪1次，術(shù)后第3年6個(gè)月隨訪1次。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，PTTG、VEGF-C陽性表達(dá)率比較采用卡方檢驗(yàn)或秩和檢驗(yàn)；淋巴管密度比較采用t檢驗(yàn)；相關(guān)性采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行描述；生存率采用Kaplan-Meier法分析，生存期限比較采用Log-rankχ2檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組宮頸組織中PTTG、VEGF-C的表達(dá)免疫組化檢測結(jié)果顯示，宮頸癌組PTTG、VEGF-C陽性表達(dá)率為69.64%、85.71%，分別顯著高于炎癥組的 6.67%、33.33%（P＜0.05），見表1。

表1 兩組組織中PTTG、VEGF-C的表達(dá)[n（%）]

2.2 PTTG、VEGF-C表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系不同腫瘤分化程度、淋巴浸潤情況及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的宮頸癌患者中PTTG表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而不同年齡、腫瘤大小、FIGO分期的患者中PTTG表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05）；不同淋巴浸潤情況及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況的宮頸癌患者中VEGF-C表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.05），而不同年齡、腫瘤大小、FIGO分期及腫瘤分化程度的患者中VEGF-C 表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＞0.05），見表2。

表2 PTTG、VEGF-C表達(dá)與宮頸癌臨床病理特征的關(guān)系

2.3 PTTG、VEGF-C表達(dá)與組織中淋巴管密度的相關(guān)性宮頸癌組患者淋巴管密度為（21.15±3.05）支/mm2，PTTG陽性表達(dá)患者淋巴管密度為（23.27±3.24）支/mm2，顯著高于陰性表達(dá)患者的（18.65±2.85）支/mm2，PTTG表達(dá)與淋巴管密度呈正相關(guān)（r=0.462，P=0.012）；VEGF-C 陽性表達(dá)患者淋巴管密度為（24.56±3.19）支/mm2，顯著高于陰性表達(dá)患者的（19.07±2.71）支/mm2，VEGF-C表達(dá)與淋巴管密度呈正相關(guān)（r=0.594，P=0.006）；PTTG 表達(dá)與VEGF-C表達(dá)呈正相關(guān)（r=0.685，P=0.000）。

2.4 PTTG、VEGF-C表達(dá)對宮頸癌患者生存情況的影響隨訪36個(gè)月，Kaplan-Meier生存曲線見圖1，PTTG陽性表達(dá)患者3年無進(jìn)展生存率為43.59%，顯著低于陰性表達(dá)患者的70.58%（Log-rankχ2=4.125，P=0.042），陽性表達(dá)患者 3 年總生存率為56.41%，顯著低于陰性表達(dá)患者的82.35%（Log-rankχ2=3.901，P=0.048）；VEGF-C 陽性表達(dá)患者3年無進(jìn)展生存率為39.58%，顯著低于陰性表達(dá)患者的 87.50%（Log-rankχ2=5.150，P=0.023），陽性表達(dá)患者3年總生存率為47.92%，顯著低于陰性表達(dá)患者的 87.50%（Log-rankχ2=3.858，P=0.049）。

圖1 不同PTTG、VEGF-C表達(dá)宮頸癌患者生存情況

3 討論

目前臨床上主要通過手術(shù)切除并輔以放化療治療宮頸癌，但大多數(shù)患者術(shù)后容易復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致宮頸癌患者預(yù)后較差[8]。研究發(fā)現(xiàn)，患者術(shù)后生存情況與腫瘤侵襲、轉(zhuǎn)移情況有關(guān)，其中轉(zhuǎn)移方式有經(jīng)淋巴管、血管和體腔轉(zhuǎn)移等，以淋巴轉(zhuǎn)移最為常見，腫瘤細(xì)胞通過組織內(nèi)新生的淋巴管實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)移[9]。淋巴管結(jié)構(gòu)特征為：由單層內(nèi)皮細(xì)胞構(gòu)成，排列疏松，基底膜缺乏或不連續(xù)，這些結(jié)構(gòu)特征使得新生淋巴管通透性更強(qiáng)，有助于腫瘤組織液體的轉(zhuǎn)移[10]。淋巴管生成的具體機(jī)制尚不明確，可能與腫瘤內(nèi)壓力較高有關(guān)，因此，癌組織內(nèi)淋巴管的密度可提示癌癥的進(jìn)展情況[11]。

PTTG是腫瘤轉(zhuǎn)化基因，首次發(fā)現(xiàn)于大鼠垂體瘤細(xì)胞，無需輔助基因可以直接介導(dǎo)細(xì)胞轉(zhuǎn)化、調(diào)控區(qū)變異、染色體結(jié)構(gòu)、細(xì)胞凋亡等過程，與腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[12]。動物實(shí)驗(yàn)表明，PTTG的表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞惡性增殖，并轉(zhuǎn)化為癌細(xì)胞；臨床研究發(fā)現(xiàn)PTTG在易發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的惡性腫瘤中（肺癌、胃癌等）異常高表達(dá)[13～15]。本研究結(jié)果顯示，宮頸癌組PTTG陽性表達(dá)率為69.64%，顯著高于炎癥組（6.67%），表明PTTG參與宮頸鱗癌的發(fā)生過程；且腫瘤分化程度低、有淋巴浸潤和轉(zhuǎn)移現(xiàn)象的宮頸鱗癌患者PTTG陽性表達(dá)率顯著高于分化程度較高、無淋巴浸潤和轉(zhuǎn)移的患者，不同年齡、腫瘤大小、FIGO分期的患者中PTTG陽性表達(dá)無顯著差異，表明PTTG可能參與宮頸鱗癌的發(fā)展過程，PTTG表達(dá)越高，腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移能力越強(qiáng)。VEGF-C是PTTG反式激活靶基因，可以促進(jìn)淋巴管的生成，PTTG的過度表達(dá)會上調(diào)VEGF-C的表達(dá)，可以特異性磷酸化激活淋巴管內(nèi)皮上受體，上調(diào)內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂速率，改變內(nèi)皮細(xì)胞通透性，促進(jìn)微淋巴管的形成[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，宮頸癌組VEGF-C陽性表達(dá)率為85.71%，顯著高于炎癥組（33.33%），提示VEGF-C參與宮頸鱗癌的發(fā)生過程；且有淋巴浸潤和轉(zhuǎn)移的宮頸鱗癌患者VEGF-C陽性表達(dá)率顯著高于無淋巴浸潤和轉(zhuǎn)移的患者，提示VEGF-C參與宮頸鱗癌的發(fā)展過程。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果表明PTTG、VEGF-C表達(dá)分別與淋巴管密度呈正相關(guān)，進(jìn)一步驗(yàn)證PTTG、VEGF-C可能通過參與微淋巴管的生成，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。隨訪結(jié)果表明PTTG、VEGF-C陽性表達(dá)患者3年無進(jìn)展生存率和總生存率均顯著低于陰性表達(dá)者，提示PTTG、VEGF-C陽性表達(dá)會縮短宮頸鱗癌患者生存時(shí)間。

綜上所述，PTTG、VEGF-C在宮頸鱗癌中異常高表達(dá)，不同腫瘤分化程度、淋巴浸潤和轉(zhuǎn)移情況患者中PTTG表達(dá)有顯著差異，不同淋巴浸潤和轉(zhuǎn)移情況患者中VEGF-C表達(dá)有顯著差異，二者分別與淋巴管密度呈正相關(guān)，且PTTG、VEGF-C陽性表達(dá)可以顯著降低患者生存率，影響宮頸鱗癌患者預(yù)后，PTTG、VEGF-C可能參與宮頸鱗癌發(fā)生發(fā)展過程，可作為宮頸鱗癌的潛在標(biāo)記物，應(yīng)用于患者預(yù)后評價(jià)。本研究樣本規(guī)模較小、隨訪時(shí)間較短，后期還需要擴(kuò)大樣本范圍、數(shù)量，并延長觀察時(shí)間深入研究。