尿激酶治療大鼠急性深靜脈血栓的實驗研究

馬建華 汪坤 李鑫

深靜脈血栓形成（deep venous thrombosis，DVT）是臨床上常見、多發的靜脈疾病，發病率達100/10萬[1]，DVT并發癥包括肺栓塞、血栓后綜合征、靜脈性壞疽，對患者健康及生活質量有很大影響。因此，如何采用更為有效的治療方法促進血栓再通成為當前研究的熱點。尿激酶亦稱為尿激酶型纖溶酶原激活物，能催化裂解纖溶酶原成纖溶酶，降解纖維蛋白凝塊和纖維蛋白原、凝血因子Ⅴ和凝血因子Ⅷ等，從而發揮溶栓作用[2]。由于其價廉、高效、出血并發癥少等優點，是主要的溶栓藥物，溶栓效果已得到肯定，但其作用機制還有待進一步研究。本研究通過建立大鼠下腔靜脈血栓模型，觀察尿激酶對血管內皮細胞、新生毛細血管、VEGF表達及細胞凋亡的影響，并探討其可能的機制。

1 材料與方法

1.1 一般資料

1.1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠20只，雄性，體質量250～280g，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司，均遵循動物實驗管理辦法，通過動物實驗倫理驗證。

1.1.2 主要試劑及儀器 兔抗血管性血友病因子（vWF）、兔抗血管內皮生長因子（VEGF），TUNEL（瑞士Roche公司）；石蠟切片機（德國萊卡公司），共聚焦顯微鏡（德國萊卡公司）。

1.2 實驗方法

1.2.1 血栓模型的制備 36g/L水合氯醛（1ml/100g）麻醉大鼠，仰臥固定于手術臺上，嚴格無菌操作。游離左腎靜脈與下腔靜脈匯合處和髂總靜脈分叉處之間的下腔靜脈段。分別在左腎靜脈匯合下腔靜脈處下方、髂總靜脈分叉處上方用顯微血管夾暫時阻斷下腔靜脈2h，經25G細針穿刺無血液流出，確認血栓形成（血管由紅色變為暗紅色）后取下血管夾關腹[3]。

1.2.2 給藥 術后1d尿激酶組給予尾靜脈注入尿激酶 20 000U/kg，每天 1次，共 10d；PBS組給予相同容量的PBS，每天1次，共10d。

1.2.3 取材 術后14d將兩組SD大鼠麻醉后進腹，取出2.0cm病變段下腔靜脈，用生理鹽水漂洗，放入10%甲醛溶液中固定，脫水后包埋，包埋好的標本用石蠟切片機切片，厚度為5μm，并將蠟片貼附于多聚賴氨酸處理過的載玻片上。

1.2.4 HE染色 將切片用二甲苯進行去蠟處理兩次；用無水乙醇進行清洗；進行4min左右的蘇木紫染色后水洗，待細胞核染成藍色后停止水洗過程；用伊紅、95%乙醇以及無水乙醇進行兩次染色；最后用苯酚二甲苯與二甲苯進行處理；中性樹膠封固。

1.2.5 組織免疫熒光 將切片置于60℃烘箱烘4h。二甲苯脫蠟，梯度乙醇水化，切片置于0.1mol/L pH為6.0的枸櫞酸液修復液中，微波煮沸10～20min進行抗原修復，室溫下冷卻20min，3%H2O2溶液處理10min阻斷內源性過氧化物酶，用PBS洗5min×3次，滴加血清封閉，濕盒中37℃封閉30min。傾去血清，4℃過夜孵育一抗（vWF、VEGF），PBS洗 3次。滴加二抗于濕盒中37℃避光孵育2h，滴加DAPI避光孵育2min，封片，熒光顯微鏡下觀察。

1.2.6 凋亡染色采用In Situ Cell Death Detection Kit（Roche公司）凋亡試劑盒，按照說明書對病變段下腔靜脈切片進行TUNEL染色，檢測細胞的凋亡情況。每組隨機選取5個視野，光學顯微鏡下觀察并計數。

1.3 統計學分析采用SPSS 13.0軟件進行統計學分析。計量資料以均數±標準差（±s）表示，兩組間比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 兩組大鼠靜脈壁血管內皮細胞數比較尿激酶組血管內皮細胞數明顯多于PBS組（P＜0.05），見圖1、表1。

圖1 兩組靜脈壁內皮細胞（×200）

2.2 兩組大鼠受累血管新生毛細血管、VEGF表達、細胞凋亡比較尿激酶組和PBS組相比，新生毛細血管數、VEGF表達、細胞凋亡差異有統計學意義（P＜0.05），見圖2～4、表1。

圖2 兩組新生毛細血管vWF染色（×200）

圖3 兩組VEGF表達（×200）

圖4 兩組細胞凋亡TUNEL染色（×200）

表1 兩組血管內皮細胞數、新生毛細血管數、VEGF表達、細胞凋亡比較（±s，個/視野）

表1 兩組血管內皮細胞數、新生毛細血管數、VEGF表達、細胞凋亡比較（±s，個/視野）

組別 血管內皮細胞數新生毛細血管數 VEGF表達 細胞凋亡PBS 組 12.46±0.52 18.68±0.63 10.56±0.49 37.17±0.32尿激酶組 38.35±0.78 42.15±0.35 35.46±0.56 11.26±0.43 P＜0.05 ＜0.05 ＜0.05 ＜0.05

3 討論

DVT是周圍血管系統的常見病和多發病之一，主要機制為靜脈淤滯、血管壁損傷以及高凝狀態[4]。手術、外傷是下肢深靜脈血栓最常見及最重要的病因。目前國內外深靜脈血栓的非手術治療主要是抗凝、溶栓、祛聚等措施。尿激酶作為臨床上應用最為廣泛的溶栓制劑，治療深靜脈血栓形成已有數十年的歷史[5]。

血栓的機化和再通是一個復雜的過程，是由多種細胞因子和細胞參與的動態的、協調的過程，包括炎細胞的浸潤、新生血管形成和再內皮化，盡管已有大量的基礎及臨床研究，但具體的機制仍不清楚[6，7]。近年研究發現尿激酶在血栓機化再通過程中發揮著重要作用[8，9]。本研究采用尾靜脈推注尿激酶造成血管局部病變部位的高纖溶環境，促使血栓更加快速有效的溶解，恢復病變血管再通，取得了滿意療效，提示尿激酶能夠增加深靜脈血栓大鼠血管內皮細胞、新生毛細血管數，促進VEGF表達，且能明顯抑制其細胞凋亡。血管內皮細胞、新生毛細血管、VEGF和細胞凋亡在尿激酶促進血栓機化和再通中的相互關系尚不明確。

尿激酶可激活纖溶酶原活化為纖溶酶，使纖維蛋白原降解而發揮溶栓作用。血管內皮受損、血流緩慢和血液高凝狀態是導致深靜脈血栓形成的三大因素[10，11]，血管內皮細胞損傷后，內皮下膠原纖維暴露，與血小板膜相互作用使得血小板活化而形成血栓，可見血管內皮細胞在血栓形成機制中處于關鍵的中心地位。血管新生是指通過血管內皮細胞的分裂增殖，在已有血管上以出芽方式長出新生的血管[12]。血管內皮細胞通過裂隙浸入血栓內逐漸形成新的血管腔和小靜脈，而使血栓部分再通，隨著血栓進一步溶解，裂隙進一步擴大，最后恢復血栓形成前的狀態，血栓完全再通。研究發現，尿激酶有保護血管內皮細胞、促進管腔再通的作用[13]；尿激酶還可減輕血栓引起的血管壁急性炎癥反應，從而減少血管內皮細胞損傷和膠原沉積，促進血管重塑[13]。VEGF是目前發現的特異性直接作用于血管內皮細胞的最重要血管生長因子之一，具有誘導新生血管生成的作用[14，15]；VEGF在血管發生/新生與重塑中起著中心調節作用，它能促進血管內皮細胞增殖，分化成熟，抑制血管內皮細胞凋亡，而且能刺激血管新生中的重要環節，增加血管內皮的通透性，形成血管生成的臨時基質，從而使新毛細血管生成和功能成熟[16]。尿激酶可使血栓內VEGF局部濃度增高，募集更多血管內皮細胞到達血栓區形成新生血管。VEGF還能夠增加纖維蛋白溶解酶、尿激酶和組織型纖溶酶原的表達和活性，這些酶可以激活纖溶酶原為纖溶酶，從而促進血栓的溶解[17]。現已證實，細胞凋亡與許多疾病的發生和發展密切相關，深靜脈血栓形成可誘發血管內皮細胞凋亡[18]，血管內皮細胞損傷除以壞死形式出現外，還可發生凋亡，血管內皮細胞的凋亡也可誘發靜脈血栓形成[19]；尿激酶在血栓栓塞性疾病中可明顯抑制細胞凋亡[20]，從而發揮溶栓作用。

綜上所述，尿激酶可通過增加血管內皮細胞、新生毛細血管、促進VEGF表達和抑制細胞凋亡促進血栓的機化和再通，為DVT的臨床治療提供更有力的參考依據。雖然尿激酶溶栓治療DVT取得了很多成果，但不同的給藥方式及劑量都會影響治療效果，而出血是溶栓治療中常見的并發癥，因此安全地、更好地發揮尿激酶的作用是需要進一步研究的課題。