成人急性B淋巴細胞白血病微小RNA和轉錄因子的生物信息學分析

蔣莉 蔡安季 文錦麗 李寧 戴勇

急性 B 淋巴細胞白血病（B-cell acute lymphoblastic leukemia，B-ALL）是由原始B淋巴細胞在骨髓、外周血或髓外組織克隆性異常增生所導致的一種急性血液系統惡性腫瘤，好發于2～5歲的兒童，在兒童以及成人的急性淋巴細胞白血病（acute lymphoblastic leukemia，ALL）中分別占85%以及75%，是最常見的一種ALL亞型[1，2]。近年來隨著對B-ALL發病機制研究的不斷深入，發現了一些有價值的診斷標志物和治療的分子靶點，同時也提出了一些更有針對性的治療方案且取得了一定的效果。但對于成人B-ALL患者，包括化療、自體外周血干細胞移植等多種方法都不能提高總體的療效，治療后復發頻繁發生；復發患者多在6個月內死亡，其5年生存率僅為7%[3]。因此，迫切需要對成人B-ALL的致病機理進行研究，以尋找新的分子靶點和治療方法。

在人類白血病中，多種細胞遺傳學缺陷均可引起轉錄因子的異常[4，5]。最近的研究發現，miRNA（microRNA，微小RNA）參與的基因表達調控在白血病的發生、發展中具有十分重要的作用[6]。miRNA與轉錄因子（Transcription factor，TF）常通過兩者之間的相互作用更精確地調節靶基因的表達，這是哺乳動物體內一種重要的基因調控模式。因此，以miRNA與轉錄因子的調控作為切入點，從系統水平上研究B-ALL的發病機制具有非常重要的意義。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 一般資料 15例成人B-ALL患者以及10例非惡性血液病對照者的骨髓標本均采集自廣東醫科大學附屬醫院血液科的住院患者。成人B-ALL患者，男7例，女8例，年齡18～71歲，平均36.5歲；全部患者均為初發病例，在采樣前均未接受化療或放療，且均符合B-ALL的診斷標準。非惡性血液病對照者為骨髓象正常的發熱或貧血原因待查的患者，其中男6例，女4例，年齡10～73歲，平均39.0歲。本研究經廣東醫科大學附屬醫院倫理學委員會批準，并征得所有患者的知情同意。

1.1.2 實驗材料 組織核蛋白抽提試劑盒、Spin column separation system 試劑盒、TranSignalTMProtein/DNA 轉錄因子芯片（美國Panomics公司）；SuperscriptTMⅢ反轉錄酶（Invitrogen 公司）；2×SYBR Green PCR 混合液（Applied Biosystems公司）。

1.2 方法

1.2.1 Illumina測序 參照我們以前的方法應用Illumina HiSeq 2000 測序系統進行高通量 miRNA測序[7]。

1.2.2 轉錄因子芯片檢測 采用美國TranSignalTMProtein/DNA轉錄因子芯片進行芯片的雜交與檢測。按照組織核蛋白抽提試劑盒說明抽提組織核蛋白，Bradford法檢測蛋白濃度。25μg的組織核蛋白抽提物與生物素標記的DNA探針混勻，15℃孵育30min，得到核蛋白/DNA探針復合物。該復合物經20g/L瓊脂糖凝膠在0.5×TBE電泳緩沖液中120V電泳20min，回收并純化核蛋白/DNA探針復合物；然后按照 Spin column separation system 試劑盒說明書洗脫、分離出游離的探針。洗脫下來的探針95℃變性3min后迅速放置在冰上2min，隨后置入雜交瓶里與芯片膜42℃雜交24h。1×封閉緩沖液室溫封閉芯片膜15min，加入HRP偶聯鏈酶素親和素抗體（1∶500），室溫孵育 15min，顯影，X 光片曝光。X光片上的圖像經ImageScanner掃描和ScanAlyze軟件處理，獲得芯片檢測數據。實驗組信號強度/對照組信號強度的比值≥2.0或≤0.5均判定差異有意義。

1.2.3 實時定量 PCR（q-PCR）使用 Oligo（dT）作為反轉錄引物，參照SuperscriptTMⅢ反轉錄酶說明書進行cDNA的合成。以18S rRNA作為內參照，根據 2×SYBR Green PCR 混合液說明書，在 ABI Prism? 7500型熒光定量PCR儀上進行q-PCR反應。q-PCR反應參數為：95℃預反應10min；然后95℃變性10s，60℃退火和延伸60s，重復40個循環。用2-△△Ct法計算miRNA的差異表達比值。

1.2.4 miRNA和轉錄因子的生物信息學關聯分析

1.2.4.1 差異表達miRNA的靶基因預測 應用miRanda、TargetScan、PicTar以及miRTarBase四個數據庫，選擇miRNA測序中差異表達倍數≥2的miRNA進行靶基因預測。其中，轉錄因子也作為基因參與miRNA的靶基因預測。為了提高靶基因預測的準確性，將 miRanda、TargetScan、PicTar三個數據庫中任意兩個數據庫預測到的靶基因與miRTarBase數據庫中已經實驗驗證的靶基因取并集獲得候選的miRNA及其靶基因。

1.2.4.2 獲取與B-ALL相關的miRNA-靶基因配對以及miRNA-靶轉錄因子配對 為了減少冗余，將上述候選的miRNA靶基因與MalaCards數據庫中B-ALL相關的基因和轉錄因子取交集，獲取與B-ALL相關的miRNA-靶基因配對以及miRNA-靶轉錄因子配對。

1.2.4.3 轉錄因子結合位點的預測 提取miRNA-靶基因配對以及miRNA-靶轉錄因子配對中的相應miRNA以及靶基因進行轉錄因子結合位點的預測。取基因轉錄起始點上游5 000 bp到下游1 000 bp區域，應用UCSC Genome Browser中的TFBS Conserved Track數據庫進行轉錄因子結合位點的預測。

1.2.4.4 生物信息學預測的轉錄因子與轉錄因子芯片檢測中差異表達轉錄因子的合并 為了提高轉錄因子結合位點預測的準確性，將生物信息學預測的轉錄因子與轉錄因子芯片檢測中差異表達倍數≥2的轉錄因子取交集，然后提取相應的miRNA以及靶基因獲得與B-ALL相關的轉錄因子-miRNA配對以及轉錄因子-靶基因配對。

1.2.4.5 構建miRNA-轉錄因子調控網絡及網絡節點分析 合并轉錄因子-miRNA配對、轉錄因子-靶基因配對、miRNA-靶基因配對以及miRNA-靶轉錄因子配對，構建miRNA-轉錄因子調控網絡并利用Gephi軟件繪制調控網絡圖。在miRNA-轉錄因子調控網絡中查找前饋環與反饋環調控模塊，并選擇連通度≥10的節點作為中心節點，鑒定出相應的核心調控因子。利用基因功能注釋工具GO（Gene Ontology，基因本體論）數據庫和KEGG數據庫對網絡節點進行GO分析和Pathway分析，查找與B-ALL相關的信號通路以及基因功能分類。

2 結果

2.1 轉錄因子的差異表達分析兩組樣本共檢測出201個差異表達的轉錄因子，其中57個轉錄因子在B-ALL組呈表達上調，144個轉錄因子呈表達下調；在芯片檢測結果中，我們選擇4個表達上調以及4個表達下調的轉錄因子，應用q-PCR技術驗證了轉錄因子芯片結果的可靠性，其檢測結果的變化趨勢一致。

2.2 構建miRNA-轉錄因子調控網絡通過合并miRNA-靶基因、miRNA-靶轉錄因子、轉錄因子-miRNA以及轉錄因子-靶基因4種配對關系見表1，我們構建了成人B-ALL的miRNA-轉錄因子調控網絡（見圖1）。

表1 B-ALL的miRNA-轉錄因子調控網絡配對關系總結

圖1 成人急性B淋巴細胞白血病的miRNA-轉錄因子調控網絡

2.3 網絡調控模塊分析以及核心調控因子的鑒定

我們從調控網絡中共鑒定出526個前饋環（feedforward loop，FFL）以及 9 個反饋環（feedback loop，FBL）調控模塊，見表2。此外，我們選擇連通度≥10的節點作為中心節點，在網絡中鑒定出47個核心調控因子，包括28個核心miRNA如miR-17-5p、miR-181b-5p、miR-29b-3p、miR-29c-3p、miR-20a-5p等；19個核心轉錄因子如CREB1、MYC、FOXO4、NFKB1、MEF2A 等。

表2 B-ALL的miRNA-轉錄因子-靶基因調控網絡中前饋環與反饋環調控模塊相關性總結

2.4 網絡節點的GO分析和Pathway分析如表2所示，網絡節點的GO分析表明，網絡節點主要參與了基因表達的正性調控、大分子代謝過程的正性調控、造血或淋巴樣器官發育等10個生物學過程。Pathway分析表明，網絡節點主要富集在癌癥信號通路、癌癥轉錄失調信號通路以及慢性髓性白血病信號通路等25個信號通路。其中，PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路、Ras信號通路以及細胞周期信號通路為目前已知的與B-ALL發病相關的信號通路。

3 討論

急性B淋巴細胞白血病是一種遺傳異質性和復雜性疾病，多種不同類型的細胞遺傳學異常以及分子遺傳學突變在B-ALL發病機制中起重要作用[8，9]。但這些遺傳學上的變異無法完全解釋其生物學特征以及遺傳異質性[9]。目前，B-ALL的發病機制尚未完全清楚。尤其，遺傳的異質性和復雜性限制了其發病機制中起主導作用的核心調控因子與核心調控模塊的發現。因此，迫切需要對其發病機制進行進一步研究。基于高通量的表達譜檢測技術以及生物信息學分析方法，系統生物學致力于在網絡水平探討生物分子的相互作用，有助于發現新的核心調控因子、調控模塊及其相關的信號通路，并在整體水平揭示疾病發生的分子機制[10，11]。因此，應用系統生物學方法研究B-ALL的發病機制具有一定的必要性。

作為一種具有基因表達調控功能的內源性小片段單鏈RNA，miRNA與轉錄因子關系密切。轉錄因子較一般基因更有可能成為miRNA調控的靶標，其作為潛在靶標的概率較一般基因高出2倍左右[12，13]。miRNA可通過與轉錄因子mRNA的3'UTR結合下調其基因表達；而miRNA在轉錄階段也可受到同一轉錄因子的調控，轉錄因子可通過與miRNA基因啟動子的轉錄因子結合位點結合，調節miRNA的轉錄；兩者之間形成一種反饋調控關系，這種調控關系模塊稱之為反饋環（feedback loop，FBL）。此外，轉錄因子除了直接調控靶基因，還可通過調節miRNA轉錄間接調控同一靶基因表達，這樣轉錄因子、miRNA和靶基因三者之間就形成了一種前饋調控關系，這種調控關系模塊稱之為前饋環（feedforward loop，FFL）。根據前饋環中起主導作用的調控因子不同，可將前饋環分為miRNA主導的前饋環（miRNA-FFL）、轉錄因子主導的前饋環（TF-FFL）以及復合的前饋環（composite FFL）三種形式[14，15]。miRNA與轉錄因子的前饋環和反饋環共調控作用是哺乳動物體內一種重要的基因調控模式。

為了探討miRNA與轉錄因子在B-ALL中的作用機制，本研究應用Illumina測序和轉錄因子芯片技術，對成人B-ALL與非惡性血液病對照組骨髓樣本的miRNA和轉錄因子的表達水平進行了對比分析，兩組樣本共檢測出差異表達的miRNA 291個（168個miRNA在B-ALL組呈表達上調，123個miRNA呈表達下調）以及差異表達的轉錄因子201個（57個轉錄因子在B-ALL組呈表達上調，144個呈表達下調）。隨后，我們應用qPCR技術分別驗證了Illumina測序以及轉錄因子芯片檢測結果的可靠性。通過運用系統生物學方法，將miRNA和轉錄因子表達譜與miRNA靶基因預測以及轉錄因子結合位點預測等生物信息學分析相結合，本研究首次構建了成人B-ALL的miRNA-轉錄因子調控網絡，從中鑒定出526個FFL以及9個FBL調控模塊。有研究報道，FFL可作為基因調控網絡的核心，在疾病分子機制中發揮關鍵調控作用[14]。本研究發現，在這些調控模塊中TF-FFL占絕大多數（93.5%）。這與文獻報道在B淋巴細胞發育的miRNA-轉錄因子調控網絡中其主要的調控模塊為TF-FFL基本一致[16]；提示TF-FFL在B細胞發育以及B-ALL發病機制中可能具有重要作用。

為了評估網絡的功能特性，本研究利用功能注釋工具GO數據庫以及KEGG數據庫對網絡節點進行了GO分析和Pathway分析。GO分析結果表明，網絡節點主要參與了包括基因表達的正性調控、大分子代謝過程的正性調控、造血或淋巴樣器官發育等10個生物學過程。其中，一半的生物學過程（包括基因表達的正性調控、造血或淋巴樣器官發育、造血、DNA依賴性的轉錄正性調控以及大分子生物合成的正性調控5個生物學過程）與B-ALL的發生、發展密切相關。Pathway分析結果表明，網絡節點主要富集在癌癥信號通路、癌癥轉錄失調信號通路以及慢性髓性白血病信號通路等25個信號通路。其中，PI3K-Akt信號通路、Jak-STAT信號通路、Ras信號通路以及細胞周期信號通路為目前已知的與 B-ALL 發病相關的信號通路[8，9，17～20]。此外，我們選擇連通度≥10的節點作為中心節點，鑒定出47個核心調控因子，包括28個核心miRNA和19個核心轉錄因子。在這些核心調控因子中，4個核心 miRNA（包括 miR-17-5p、miR-125b-5p、miR-18a-5p和miR-34a-5p）以及5個核心轉錄因子（包括MYC、STAT5A、STAT5B、FOXO1和HLF）已有文獻報道與B-ALL發病機制相關；其余的24個核心miRNA和14個核心轉錄因子為新發現的調控因子。

綜上所述，本研究首次構建了成人B-ALL的miRNA-轉錄因子調控網絡，從整體水平上闡述miRNA和轉錄因子對B-ALL相關基因的調控機制。多種核心調控因子可能成為B-ALL潛在的分子靶點，用于B-ALL發病機制的進一步研究。