紅景天苷對小鼠抗血小板活性和抗血栓作用*

林曉堅， 袁兆偉， 潘彩燕， 孫黔云， 宛蕾**

(1.貴州醫科大學 基礎醫學院 藥理學教研室， 貴州 貴陽 550025； 2.貴州省中國科學院 天然產物化學重點實驗室， 貴州 貴陽 550014)

血栓性疾病是由血栓形成和血栓栓塞兩種病理過程引起的一類疾病，前者是指血液中的有形成分在血管中形成栓子，造成血管部分或完全堵塞；后者則是指血栓自形成部位脫落，隨血液循環部分或全部堵塞某些血管[1]。血栓性疾病有高死亡率和高致殘率的特點，其中血小板活化異常是血栓形成的重要病理學基礎[2-3]。抗血小板治療已成為預防動脈粥樣硬化性疾病，尤其是冠心病的重要治療手段[4]，因此具有抗血小板活性的藥物對于防治血栓有著重要作用。紅景天是大花紅景天(rhodiolaroseaL.)的干燥根莖和根，是藏醫常用藥材，紅景天苷(salidroside，Sal)則是紅景天的主要有效成分[5]。研究表明，Sal有廣泛的藥理作用，如抗氧化、抗動脈粥樣硬化、心肌保護、神經保護、腦保護、抑制血小板聚集等[6-11]，但目前對其抗血小板活性和抗血栓作用研究少有報道。因此，本研究采用小鼠斷尾出血時間和角叉菜膠誘導的體內血栓模型，觀察Sal抗血小板活性和抗血栓作用，為臨床抗血栓和抗血小板藥物的研發提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物、藥物、試劑及儀器

1.1.1實驗動物 清潔級昆明小鼠160只，體質量18～22 g，雌鼠60只，雄鼠100只，由貴州醫科大學實驗動物中心提供，合格證號為SCXK(黔)2018-0001。實驗前均適應性喂養3 d。

1.1.2藥物及試劑 Sal購自上海瓦蘭生物科技有限公司(批號HJT20180812，純度≥98%)，角叉菜膠購自Sigma公司(22048-25G Type κ，批號BCBG5890V)，水合氯醛購自國藥集團化學試劑有限公司(批號20170803)，二水合檸檬酸三鈉購自國藥集團化學試劑有限公司(批號20170718)，阿司匹林腸溶片購自大同市利群藥業有限責任公司(批號170605)。

1.1.3儀器 BC-5130型全自動血液細胞分析儀購自深圳邁瑞生物醫療電子股份有限公司，5810R型高速冷凍離心機購自德國Eppendorf公司，移液器購自德國Eppendorf公司，XS205型萬分之一電子天平購自瑞士梅特勒-托利多科學儀器公司產品，RP6002K型電子天平購自常州銳品精密儀器有限公司，RAC-1830全自動凝血分析儀購自美國Rayto公司。

1.2 方法

1.2.1體質量及血細胞數目的測定 取40只昆明小鼠，雌雄各半，隨機分為對照組(生理鹽水)、陽性藥組(阿司匹林100 mg/kg)、Sal高劑量組(Sal 100 mg/kg)和Sal低劑量組(Sal 50 mg/kg)。每日稱重小鼠，記錄體質量，按照體質量腹腔注射給藥1次/d，給藥體積為10 mL/kg，連續7 d；末次給藥30 min后，將小鼠麻醉(4%水合氯醛，400 mg/kg)、固定、采血(3.8%枸櫞酸鈉抗凝，抗凝劑與血液體積之比為1 ∶9)，檢測白細胞(white blood cell，WBC)、紅細胞(red blood cell，RBC)、血小板計數(platelet，PLT)和平均血小板體積(mean plate volume，MPV)。

1.2.2凝血4項的測定 取昆明小鼠40只，雌雄各半，分組給藥同1.2.1。末次給藥30 min后，將小鼠麻醉、固定、采血，檢測凝血酶原時間(prothrombin time ，PT)、活化部分凝血酶時間(activated partial thromboplastin time， APTT)、凝血酶時間(thromboplastin time，TT)和纖維蛋白原(fibrinogen，FIB)。

1.2.3小鼠斷尾出血時間測定 取昆明小鼠40只，雌雄各半，分組給藥同1.2.1。參照文獻[12]末次給藥30 min后，小鼠麻醉(4%水合氯醛，400 mg/kg)，在距離尾尖4 mm 處剪斷，濾紙擦去第一滴血，隨后將鼠尾放入37 ℃生理鹽水中，待小鼠尾部停止流血后，繼續觀察60 s，如停止出血則以該時間為小鼠尾巴出血時間，若尾部再次出血則繼續計時，到15 min出血未停止，則記為15 min。

1.2.4小鼠尾部血栓測定 取雄性昆明小鼠40只，隨機分為4組，分組給藥同1.2.1。腹腔注射給藥1次/d，至第5天給藥30 min后，各組腹腔注射角叉菜膠(20 mg/kg，10 mL/kg)[13]第6天、第7天按分組持續給藥；分別測量并記錄給予角叉菜膠12 h、24 h、48 h后的黑尾率以及黑尾長度。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 體質量

各組小鼠實驗開始時體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)；實驗開始后各組小鼠每日體質量均有增長，腹腔給藥第7天相較于給藥第1天，各組小鼠體質量均有明顯增加，差異有高度統計學意義(P<0. 01)，但同日各組小鼠體質量比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

2.2 血細胞、PLT和MPV

實驗表明，各組小鼠WBC、RBC、PLT和MPV比較，差異無統計學意義(P>0.05)。見表2。

時間小鼠體質量對照組(n=10)陽性藥組(n=10)Sal低劑量組(n=10)Sal高劑量組(n=10)第1天21.14±0.9221.74±0.8421.89±0.7921.46±0.70第2天22.35±0.7222.57±1.1722.26±1.4321.99±1.67第3天23.30±1.0523.24±1.1723.40±1.2023.55±1.15第4天24.56±0.8324.11±1.4124.78±1.3924.73±1.22第5天25.17±1.4025.76±1.3925.21±1.2025.59±1.39第6天26.18±1.3526.29±1.1126.37±1.2426.61±1.30第7天26.83±1.41(1)27.04±1.48(1)27.43±1.35(1)27.34±1.37(1)

注：(1)與同組第1天比較，P<0.01。

指標對照組(n=10)陽性藥組(n=10)Sal低劑量組(n=10)Sal高劑量組(n=10)FPWBC(×109/L)3.47±0.993.61±1.043.33±0.903.05±0.950.4920.994RBC(×1012/L)8.72±0.688.37±0.588.46±0.578.65±0.720.5720.877PLT(×109/L)559.60±91.60 566.10±107.30572.60±109.10543.10±146.800.1070.577MPV(fL)5.54±0.355.83±0.395.63±0.405.66±0.460.8230.490

2.3 凝血4項指標

與對照組小鼠相比，Sal高、低劑量組小鼠PT、APTT、TT及FIB差異均無統計學意義(P>0.05)。見表3。

2.4 小鼠斷尾出血時間

陽性藥組、Sal低劑量組和Sal高劑量組小鼠斷尾平均出血時間分別較對照組為長，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，但其余各組之間比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表4。

2.5 小鼠黑尾率及黑尾長度

造模12 h時，對照組小鼠黑尾率明顯高于Sal高劑量組小鼠，差異有高度統計學意義(P<0.01)，

指標對照組(n=10)陽性藥組(n=10)Sal低劑量組(n=10)Sal高劑量組(n=10)PT(s)12.22±0.5512.44±0.8912.37±0.6512.26±0.61APTT(s)22.60±1.3626.60±2.83(1)22.80±1.3322.79±1.28TT(s)18.99±1.0418.90±1.1019.10±1.0518.91±1.07FIB(g/L)1.76±0.141.73±0.161.77±0.171.82±0.17

注：(1)與對照組比較，P<0.01。

表4 各組小鼠斷尾出血時間比較Tab.4 Effect of Sal on mice tail bleeding time

注：與對照組比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

但陽性藥組小鼠和Sal低劑量組小鼠間黑尾率比較差異無統計學意義(P>0.05)；造模24 h時，對照組小鼠黑尾率高于陽性藥組和Sal高劑量組小鼠，差異有統計學意義(P<0.05)；造模48 h時，各組小鼠間黑尾率差異均無統計學意義(P>0.05)。在造模12 h、24 h和48 h時，與對照組小鼠相比，陽性藥組、Sal低劑量組和Sal高劑量組小鼠黑尾長度均有縮短，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，提示Sal有改善小鼠血栓形成的作用。見表5、圖1。

表5 各組小鼠黑尾率及黑尾長度Tab.5 Effect of Sal on black tail rate and black tail length of mice

注：與對照組同時間比較，(1)P<0.05，(2)P<0.01。

對照組 陽性藥組 Sal低劑量組 Sal高劑量組圖1 各組小鼠在角叉菜膠誘導48 h時黑尾長度Fig.1 Tail thrombosis length of different groups at 48 h after carrageenan induction

3 討論

近年來，我國心血管疾病發病率持續升高，心血管疾病造成的死亡人數已居各類疾病死亡率的首位[14]。血栓性疾病在心血管疾病中比例很高，其中血小板功能異常導致的血栓形成和栓塞并發癥是心血管疾病發病的主要原因[15]。抗血栓藥物是防治血栓性疾病的重要手段，其中中藥及其制劑對于抗血小板和抗血栓有著獨到的療效，且副作用小[16]。本研究結果顯示，Sal對小鼠的體質量增長并無明顯影響，對小鼠血細胞計數以及平均血小板體積均未產生明顯影響。平均血小板體積可反應血小板體積以及體積的差異程度，該指標亦可體現血小板的產率及激活，相對于血小板計數，平均血小板體積更能反映血小板功能[17]。小鼠斷尾出血是測定血小板功能的整體模型，包括血小板功能、血小板計數以及凝血系統在內的因素均可影響機體的止血功能[18]。同時，Sal對小鼠的凝血4項并無明顯影響，則排除了小鼠凝血系統的影響。據此，本研究推測Sal可以延長小鼠出血時間，原因可能是通過抗血小板活性實現的。

角叉菜膠又名卡拉膠，是從紅藻中提取的多糖物質的統稱，屬于較強的致炎物質，可用于復制炎癥模型[19]。已有研究顯示，皮下注射以及腹腔注射一定劑量的角叉菜膠可誘導小鼠尾部形成血栓[20]。此法復制的模型，血栓直觀、肉眼可見，易于測量和觀察，可用于抗血栓藥物的評估[21-22]。參考文獻多采用雄性小鼠進行造模，預實驗觀察到雌性小鼠經相同給藥途徑注射相同劑量的角叉菜膠后，其尾部血栓發生率以及血栓長度均低于雄性小鼠，故本研究亦采取了雄性小鼠進行實驗。研究結果表明，Sal低、高劑量對延緩小鼠尾部血栓形成，減少尾部血栓長度均有作用，提示Sal對血栓形成具有明顯的抑制作用。

綜上所述，Sal對血栓形成具有明顯的抑制作用，可能與其抗血小板功能活性有關，從而為Sal用于血栓性疾病的防治提供了理論基礎。