HPLC法測定安神補心片中6種成分含量

劉莉，李婷婷 ，何君怡

(1.成都市食品藥品檢驗研究院，成都 610045；2.同濟大學附屬楊浦醫院，上海 200090)

安神補心片處方來源于國家藥品監督管理局頒藥品標準，標準號為WS-11407(ZD-1407)-2002[1]。主要由丹參、石菖蒲、五味子(蒸)、首烏藤、墨旱蓮、合歡皮、菟絲子、女貞子、地黃、珍珠母共10味中藥組成。臨床用于治療心血不足、虛火內擾所致的心悸失眠、頭暈耳鳴。方中丹參具活血通經、清心除煩、養血安神等功效[2-3]，其中丹參酮ⅡA、丹酚酸B為丹參中主要有效成分[4-5]；五味子具鎮靜安神、收斂固澀、益氣生津、寧心安神的功效，主治心神失養之虛煩心悸、失眠多夢等癥狀[6-8]，五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素為五味子主要有效成分[9-11]；首烏藤具有安五臟、和心志、養血、祛風、止痛、鎮靜、催眠等作用，可調和陰陽而促進入睡，用于失眠多夢、血虛身痛等[12-14]，2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷為2015年版《中華人民共和國藥典》規定首烏藤中指標性成分。原局頒標準僅對處方中丹參酮ⅡA進行含量測定。近年來，相關含量測定方法已有很多報道[15-17]，但同時測定6個成分的方法筆者尚未見報道。本實驗參考上述參考文獻，經多次摸索實驗條件，建立了同時測定安神補心片中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的高效液相色譜(HPLC)法。該方法準確、簡便，靈敏度高，為安神補心片質量標準的完善提供依據，對其質量控制具有重要意義。

1 儀器與試藥

1.1儀器 Agilent1200高效液相色譜儀(包括G1311A四元泵，G1329A自動進樣器，G1316A柱溫箱，G1315D DAD二極管陣列檢測器，美國安捷倫公司)；AE-240電子天平(德國賽多利斯公司，感量：0.01 mg)；AEG220電子天平(日本島津公司，感量：0.1 mg)；SK250H超聲儀(上海科導超聲儀器有限公司)；Millipore-Q Gradient 超純水裝置(美國密理博公司)。

1.2試藥 丹參酮ⅡA對照品(批號：110766-201721，含量：99.5%)、丹酚酸B對照品(批號：111562-201716，含量：94.1%)、五味子醇甲對照品(批號：110857-201714，含量：99.9%)、五味子甲素對照品(批號：111764-201714，含量：99.3%)、五味子乙素對照品(批號：110765-200710)、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品(批號：110844-201512，含量：91.0%)，均由中國食品藥品檢定研究院提供；安神補心片(糖衣片，太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號：1711004)、安神補心片(薄膜衣片，太極集團四川綿陽制藥有限公司，批號：1710004，1712005)、安神補心片(太極集團浙江東方制藥有限公司，批號：17080012)、安神補心片(比智高藥業有限公司，批號：170501)；乙腈為色譜純，水為Millipore裝置制備的超純水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1色譜條件 色譜柱：Sunfire C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：A相為乙腈，B相為0.2%磷酸，梯度洗脫程序見表1；進樣量5 μL；紫外檢測波長210，270和320 nm；柱溫35 ℃。

表1 流動相梯度洗脫程序

2.2溶液的制備

2.2.1對照品溶液的制備 取丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品，精密稱定，置于25 mL量瓶中，加75%甲醇制成每毫升含丹參酮ⅡA 0.249 5 mg、丹酚酸B 0.762 2 mg、五味子醇甲0.277 7 mg、五味子甲素0.202 6 mg、五味子乙素0.247 6 mg、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷 0.197 6 mg溶液，作為對照品儲備溶液。分別精密吸取上述對照品溶液適量，稀釋成不同濃度系列混合對照品溶液。

2.2.2供試品溶液的制備 取質量差異項下本品，研勻，取1.0 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50 mL，密塞，稱定質量，超聲處理30 min，放冷，再稱定質量，用75%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，棄去初濾液，即得。

2.3系統適應性實驗 按照“2.1”項色譜條件，取對照品溶液和供試品溶液進樣測定，記錄色譜圖，見圖1。在選定的色譜條件下，6種成分的理論板數均不低于200 000，色譜峰與相鄰峰的分離度均>1.5。

2.4線性關系考察 精密吸取不同濃度系列混合對照品溶液，分別依次進樣，測定色譜峰面積，以對照品進樣量為橫坐標，峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。結果見表2。

2.5精密度實驗 精密吸取同一濃度混合對照溶液5 μL，重復進樣6次，測定其峰面積，結果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分別為0.51%，0.59%，0.79%，0.56%，0.62%，0.56%。

2.6穩定性實驗 精密吸取同一安神補心片供試品溶液(批號：1710004)5 μL，分別于1，2，4，8，12，18，24 h進樣，測定其峰面積。結果丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分別為2.05%，1.82%，2.42%，2.05%，2.35%，1.27%。表明溶液在24 h內基本穩定。

2.7重復性實驗 精密稱取安神補心片(批號：1710004)6份，按“2.2”項下樣品的制備處理樣品，按上述色譜條件，測定峰面積。結果樣品中丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的RSD分別為1.48%，1.22%，2.35%，2.17%，2.10%，1.45%。

A.混合對照品(210 nm)；B.混合對照品(270 nm)；C.混合對照品(320 nm)；D.供試品 (210 nm)；E.供試品 (270 nm)；F.供試品 (320 nm)；1.五味子醇甲；2.五味子甲素；3.五味子乙素；4.丹酚酸B；5.丹參酮ⅡA；6.2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷。

表2 6種有效成分回歸方程、相關系數和線性范圍

2.8回收率實驗 精密稱取已知含量安神補心片(批號：1710004)0.5 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，按1：1比例精密添加丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷對照品適量，按供試品制備方法處理，進樣5 μL，測定。結果表明丹參酮ⅡA、丹酚酸B、五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素、2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的回收率(n=6)分別為98.05%(RSD=1.14%)，99.25%(RSD=1.35%)，98.14%(RSD=1.89%)，97.80%(RSD=2.84%)，96.35%(RSD=2.09%)，99.16%(RSD=1.31%)。

2.9樣品的測定 取安神補心片5批，照供試品溶液制備方法處理，測定。按外標法以峰面積計算。測定結果見表3。

表3 每片安神補心片中6種有效成分的含量 mg，n=3

3 討論

3.1檢測波長的確定 通過DAD檢測器，在200～400 nm波長范圍內進行光譜掃描，可知丹參酮ⅡA在270 nm處有最大吸收、丹酚酸B在240～340 nm波長范圍吸收強度相似，故將丹參酮ⅡA、丹酚酸B的檢測波長定為270 nm；五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素吸收曲線相似，在210 nm處均有較大吸收值，故將五味子醇甲、五味子甲素、五味子乙素的檢測波長定為210 nm；2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷在 320 nm處有最大吸收，故將2，3，5，4′-四羥基二苯乙烯-2-O-β-D-葡萄糖苷的檢測波長定為320 nm。

3.2流動相的選擇 分別以乙腈-0.2%磷酸溶液、甲醇-0.2%磷酸溶液為流動相，分別采用等度洗脫與梯度洗脫，流速均為1.0 mL·min-1，結果表明，等度洗脫不能有效地、高分辨地洗脫出全部對照品組分，特別是丹參酮ⅡA與五味乙素分離不好。而甲醇作為流動相在210 nm的末端吸收影響大。乙腈-0.2%磷酸溶液梯度洗脫時，丹參酮ⅡA與五味乙素分離較好，且保留時間適中。故選擇乙腈-0.2%磷酸溶液為流動相。

3.3樣品處理方法的確定 分別考察甲醇、75%甲醇對供試品的提取結果的影響，根據測定結果、空白實驗及回收率實驗證實，75%甲醇提取既能排除干擾，又可以達到提取完全。故選擇75%甲醇為提取溶劑。另考察超聲處理與加熱回流及處理時間長短對實驗的影響。結果表明超聲30 min已基本提取完全，且超聲處理與加熱回流效果相差不大，故確定提取方式為超聲處理30 min。