響應面法優化月季花中總黃酮的提取工藝

錢慧琴，秦晶晶，李亞杰，劉林煜，閆福林，2，*

（1.新鄉醫學院三全學院，河南新鄉453000；2.新鄉醫學院，河南新鄉453000）

月季花（Rosac hinensisJacq.）屬于薔薇科（Rosaceae），薔薇屬（Rosa）常綠灌木[1]，因花期綿長，又稱為“月月紅”。花大艷麗，可作為庭院觀賞植物，目前應用于化妝品和食品行業，作為精油提煉、制備香料、天然色素提取和食品加工的原料。花可入藥，具有活血調經、消腫解毒、疏肝解郁之效，用于治療月經不調，經來腹痛，跌打損傷，血瘀腫痛，癰疽腫毒等證[2]。經過大量試驗研究表明，月季花含有多種化學成分，主要含有黃酮類、酚酸類、鞣質類、揮發油等成分[3-6]，其中，黃酮類化學物質在抗菌[7]、抗氧化[3]、抗腫瘤[4]等方面顯示較好的生物活性。目前，對于月季總黃酮的含量測定已經有相關報道[8]，但是針對月季花中總黃酮提取工藝的優化鮮有報道。本試驗采用響應面法優化月季花中總黃酮的提取工藝，確定出最佳的提取工藝條件，旨在為月季花資源的開發利用提供理論支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

月季葉：2018 年4 月采集于新鄉醫學院三全學院校園；蘆丁對照品（批號：100080-201408）：中國食品藥品檢定研究院；乙醇、NaNO2等試劑均為分析純：天津科密歐化學試劑有限公司。

電熱鼓風恒溫干燥箱（101-8）：江蘇金壇市佳美儀器有限公司；新世紀紫外可見分光光度儀（T6）：北京普析通用儀器有限公司；數顯恒溫水浴鍋（HH-S）：金壇市金南儀器廠；電子分析天平（HA2004）：上海象平儀器儀表有限公司；循環水式真空泵（SHZ-D II）：鞏義市予華儀器有限責任公司；旋轉蒸發儀（R206）：上海申生科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 月季花預處理

將采集的月季花洗凈，用濾紙吸干，于60 ℃烘干，粉碎，過篩，將烘干樣品放入廣口瓶中，備用。

1.2.2 標準曲線的制備

精密配制質量濃度為0.1 mg/mL 的蘆丁對照品溶液，精密吸取 0.40、0.80、1.20、1.60、2.00、2.40、2.80 mL的蘆丁對照品溶液置于10 mL 容量瓶中，隨后分別依次加入0.4 mL 5%亞硝酸鈉，搖勻，放置6 min 后加入0.4 mL 10%硝酸鋁，放置6 min，最后加入4 mL 4%NaOH 溶液，加蒸餾水定容，搖勻，放置15 min，用紫外-可見分光光度計于510 nm 處測定其的吸光度A510。以蘆丁濃度C（μg/mL）為橫坐標，吸收度A 為縱坐標繪制標準曲線，見圖1。

圖1 標準曲線Fig.1 The figure of standard curve

由圖1 標準曲線得到回歸方程為：y=0.011 3 x+0.018 4，相關系數R2=0.999 2。此方程具有良好的線性關系，可用于評價月季花總黃酮的質量濃度。

1.2.3 月季花中總黃酮的提取

精密稱定月季花粗粉約1 g，置于100 mL 圓底燒瓶中，按一定的液料比例，加入不同濃度的乙醇溶液搖勻后，在一定的溫度下進行加熱回流提取一定時間，過濾至100 mL 圓底燒瓶中，于55 ℃減壓濃縮至干，加水20 mL 懸浮，加石油醚洗滌3 次，棄去石油醚部分，水相再加乙酸乙酯萃取3 次，合并乙酸乙酯部分，水浴蒸干，加乙醇溶解后定量轉移至100 mL 容量瓶中，乙醇稀釋至刻度即得供試品溶液，待測。

1.2.4 月季花中總黃酮含量測定

精密吸取月季葉花供試品溶液1.00 mL，置于10 mL容量瓶中，按“1.2.2”項下方法測吸光度。月季花中總黃酮質量濃度按照蘆丁標準曲線回歸方程進行計算。黃酮提取率計算公式如下：

式中：Y 為月季花中總黃酮提取率，mg/g；C 為月季花中總黃酮類化合物的質量濃度，mg/mL；m 為樣品質量，mg。

1.2.5 單因素試驗

按照“1.2.3”項下的方法分別考察乙醇體積分數（30%、50%、60%、70%、80%、95%）、提取溫度（50、60、70、80、90 ℃）、液料比[15 ∶1、20 ∶1、30 ∶1、40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（ mL/g）]、提取時間（30、60、80、100、120 min）4個因素對月季花中總黃酮提取率的影響。

1.2.6 響應面試驗

根據單因素試驗結果，確定響應面的優化范圍，根據Box-Behnken 試驗設計原理為依據，以乙醇體積分數（A）、提取溫度（B）、液料比（C）、提取時間（D）為自變量，固定提取次數為1 次，總黃酮提取率為因變量，采用四因素三水平響應面優化工藝，利用統計分析軟件Design expert 8.0.6 建立數學回歸模型，確定月季葉總黃酮最佳提取工藝條件，試驗設計因素水平見表1。

表1 響應面分析因素與水平Table 1 Coded levels and corresponding actual levels of independent variables used for Box-Behnken design

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果與分析

2.1.1 乙醇體積分數的影響

乙醇體積分數對月季花中總黃酮提取率的影響見圖2。

圖2 乙醇體積分數對月季花總黃酮提取率的影響Fig.2 Effect of ethanol concentration on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由圖2 可知，月季花中總黃酮提取率隨著乙醇體積分數的增加而增加，當乙醇體積分數達到70%時，總黃酮提取率達到最大。當乙醇體積分數大于70%時，月季花總黃酮的提取率隨著乙醇體積分數的增加而下降。這可能是因為當乙醇體積分數達到70%時，黃酮類物質溶出趨于飽和，隨著乙醇體積分數的增加，其他醇溶性物質溶出也增多，使得黃酮提取率反而下降。所以，確定最佳乙醇體積分數為70%。因此，在響應面試驗中，選擇60%、70%、80%3 個水平進行響應面優化。

2.1.2 提取溫度的影響

提取溫度對月季花總黃酮提取率的影響見圖3。

圖3 提取溫度對月季花總黃酮提取率的影響Fig.3 Effects of extraction temperature on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由圖3 可知，隨著提取溫度的升高，月季花總黃酮的提取率隨之增加。當溫度達到80 ℃時總黃酮提取率達到最高，之后迅速降低。可能是因為當溫度較低時，總黃酮得不到充分的提取，但是過高的溫度又會導致黃酮類物質化學結構發生變化，轉變成非黃酮類成分，其他醇溶性物質隨著溫度升高溶出增加，最終導致總黃酮提取率迅速降低。所以，確定最佳提取溫度為 80 ℃。因此，在響應面試驗中，選擇 70、80、90 ℃3 個水平進行響應面優化。

2.1.3 液料比的影響

料液比對月季花總黃酮提取率的影響見圖4。

圖4 液料比對月季花總黃酮提取率的影響Fig.4 Effects of liquid-to-solid ratio on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由圖4 可知，在液料比 15 ∶1（mL/g）～50 ∶1（mL/g）內，月季花總黃酮提取率隨液料比的增大而增加。當液料比大于50 ∶1（mL/g）時，總黃酮提取率反而下降。這可能是因為增加提取溶劑與原料的比例，有利于黃酮類物質的溶出，但是，當液料比達到50 ∶1（mL/g）時，黃酮類物質的溶出達到飽和，繼續增加液料比，會使其他雜質的溶出增多，同時會增加后續提取液的濃縮時間。所以，確定最佳液料比為 50 ∶1（mL/g），因此，在響應面試驗中，選擇液料比例為 40 ∶1、50 ∶1、60 ∶1（mL/g）3 個水平進行響應面優化。

2.1.4 提取時間的影響

提取時間對月季花總黃酮提取率的影響見圖5。

圖5 提取時間對月季花總黃酮提取率的影響Fig.5 Effect of extraction time on extraction yield of total flavonoids from Rosa chinensis

由圖5 可知，在提取時間 50 min～100 min 范圍內，月季花總黃酮提取率明顯增加，當提取時間超過100 min時，隨著提取時間增加總黃酮提取率反而下降，這可能是因為提取時間過短黃酮類化學物質溶解不充分，不能有效提取出來，但是提取時間過長導致黃酮類物質化學結構遭到破壞，導致總黃酮提取率降低。所以，確定最佳提取時間為100 min。因此，在響應面試驗中，選擇提取時間80、100、120 min 3 個水平進行響應面優化。

2.2 響應面法優化月季花總黃酮提取工藝

2.2.1 響應面試驗設計結果

在單因素試驗基礎上，選用響應面分析法對月季花總黃酮的提取工藝條件進行優化。試驗方案設計及結果見表2。

表2 響應面優化試驗設計與結果Table 2 Experimental design with experimental values of flavonoid yield for response surface analysis

2.2.2 多元二次響應面回歸模型的建立及顯著性分析

利用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗結果進行多元回歸分析，得到擬合全變量二次回歸方程：Y=12.53-0.69A+1.61B+0.83C-1.02D+0.21AB+0.79AC+0.52AD+0.23BC-2.04BD+0.27CD+1.74A2+1.08B2+0.92C2+1.06D2（R2=0.966 7），響應面多元二次模型方差分析結果見表3。

表3 響應面二次模型方差分析Table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

續表3 響應面二次模型方差分析Continue table 3 The response surface quadratic model analysis of variance

由表3 可知，模型的 F=29.05，P＜0.000 1，表明該模型極顯著；失擬項P=0.054 4＞0.05，說明失擬項不顯著；該模型相關系數 R2=0.966 7 和調整系數R2Adj=0.933 4，說明93.347%響應值的變化是由獨立變量決定，只有6.66%的總變異系數不能由該模型來解釋，模型的變異系數為3.51%，在可接受的范圍內，說明該試驗值有較高的精密度及可靠性。綜上所述，可以通過該方程來預測月季花總黃酮的最佳提取工藝。一次項影響因素A、B、C、D 有顯著影響，根據F 值的大小，得出對月季花中總黃酮提取率各因素的影響依次是：提取溫度（B）＞提取時間（D）＞液料比（C）＞乙醇體積分數（A）。交互項中，AC、BD 有顯著影響，說明乙醇體積分數和液料比、提取溫度和提取時間的交互作用對月季花總黃酮提取率有顯著影響；二次項中A2、B2、C2、D2都有極顯著影響，說明各因素對響應值的影響不是簡單的線性關系，而是存在一定交互作用。

2.2.3 響應面優化

應用Design-Expert 8.0.6 軟件擬合繪制三維響應曲面圖及相應的等高線圖見圖6～圖11。

圖6 乙醇體積分數與提取溫度的響應曲線Fig.6 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and extraction temperature

圖7 乙醇體積分數與液料比的響應曲線Fig.7 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and solvent-to-solid ratio

圖8 乙醇體積分數與提取時間的響應曲線Fig.8 Response surface methodology analysis for interactive effects of alcohol concentration and extraction time

響應面圖坡度的陡峭程度直觀地反映了各因素對響應值的影響，響應面坡度陡峭，說明兩因素交互作用明顯，反之，響應面坡度平緩，說明兩因素交互作用不明顯。等高線的形狀也可以反映各因素的交互影響是否顯著，若等高線為圓形，則表明兩變量之間的交互影響不顯著；若為橢圓形，則表明兩變量之間的交互影響顯著[9-10]。圖7、圖10 表現出響應面陡峭，等高線呈現橢圓形，說明乙醇體積分數與液料比、提取溫度與提取時間交互作用對月季花總黃酮提取率的影響顯著；圖6、圖8、圖9、圖11 表現出響應面平緩，等高線呈現近圓形，說明乙醇體積分數與提取溫度、乙醇體積分數與提取時間、提取溫度與液料比、液料比與提取時間交互作用對月季花總黃酮提取率的影響不顯著。這與響應面顯著性分析結果一致。

2.2.4 最優工藝及驗證試驗

圖9 提取溫度與液料比的響應曲線Fig.9 Response surface methodology analysis for interactive effects of extraction temperature and solvent-to-solid ratio

圖10 提取溫度與提取時間的響應曲線Fig.10 Response surface methodology analysis for interactive effects of extraction temperature and extraction time

圖11 液料比與提取時間的響應曲線Fig.11 Response surface methodology analysis for interactive effects of solvent-to-solid ratio and extraction time

利用Design-Expert 8.0.6 軟件進行優化，對回歸模型求解方程，得出月季花總黃酮最佳提取工藝為：乙醇體積分數60.48%，提取溫度86.97 ℃，液料比42.02 ∶1（mL/g），提取時間 85.56 min，此條件下月季花總黃酮提取率最高，預測值為19.492 mg/g。為了驗證模型的有效性，并結合實際情況將最佳提取工藝條件改為乙醇體積分數60 %、提取溫度87 ℃、液料比42 ∶1（mL/g）、提取時間 85 min，在此工藝條件下，月季花總黃酮提取率為19.15 mg/g，與模型預測值基本吻合，說明所得模型可以用來預測月季花中總黃酮提取率，對提取工藝條件參數優化可靠可行。

3 結論

在單因素試驗的基礎上，采用響應面法對月季花總黃酮提取工藝條件進行優化，通過Box-Behnken 設計試驗，運用Design-Expert 8.0.6 軟件對試驗結果進行多元回歸分析，建立月季花總黃酮提取工藝的二次多項式回歸模型，以及各個因素之間的交互作用對月季花中總黃酮得率的影響，確定最佳提取工藝。根據實際操作條件，將月季花總黃酮得率的最佳提取工藝修正為乙醇體積分數60 %、提取溫度87 ℃、液料比42 ∶1（mL/g）、提取時間 85 min，為月季花資源的開發、綜合利用及其質量控制提供理論依據。