原始森林高產纖維素酶刺器腐霉的篩選鑒定

何海燕，付躍，秦文芳，張玉蘭，甘小富，覃擁靈，*

（1.河池學院化學與生物工程學院，廣西宜州546300；2.微生物及植物資源開發利用廣西高校重點實驗室，廣西宜州546300）

纖維素是植物纖維的主要成分，約占植物總干重的30%～50%[1]，是分布最廣的天然碳水化合物，也是地球上最豐富、最廉價的可再生資源。Z˙ywicka 等估計全世界每年通過光合作用產生的纖維素高達1.55×109噸，其中89%尚未被人類利用[2]。利用微生物生產的纖維素酶將其轉化為人類急需的能源食物和化工原料，對人類社會的可持續發展具有非常重要的意義。纖維素酶在食品、飼料、紡織和洗滌等行業具有較大的應用潛力。Stevenson 研究認為篩選出產高活性纖維素酶的菌株是開發利用纖維素資源的前提和關鍵[3]。

本課題以原始森林腐爛木材下的土壤為原料，以羧甲基纖維素鈉（carboxyl methyl cellulose，CMC-Na）為唯一碳源進行篩選，純化并經過剛果紅染色鑒定后，得到4 株產透明圈的菌株。對該菌株進行葡聚糖內切酶（endo-glucanase，CMCase）活性鑒定，完成高產纖維素酶菌種篩選鑒定研究，為纖維素酶進一步的研究工作奠定了基礎。

1 材料與儀器

1.1 試劑

參照張煒煒方法配置pH 4.8 醋酸-醋酸鈉緩沖液[4]；3，5-二硝基水酸溶液：上海如吉生物科技發展有限公司；0.9%生理鹽水：微生物及植物資源開發利用廣西高校重點實驗室配置；參照杜健配置3，5-二硝基水楊酸溶液（3，5-dinitrosalicylic acid，DNS）[5]；參照陳玉方法配置1%CMC-Na[6]，溶液稱取0.625 g 羧甲基纖維素鈉，加熱溶解于pH4.8 醋酸-醋酸鈉緩沖液并定容至100 mL。

樣品：采自廣西羅城小長安水上相思林原始森林腐木下，取腐爛木材地表下5 cm～15 cm，100 g，保鮮膜密封，4 ℃保存備用。

1.2 儀器與設備

BX51 顯微鏡：奧林巴斯（OLYMPUS）專業公司；GZX-GF101-2S 電熱恒溫鼓風干燥箱、SPX-150 生化培養箱：上海躍進醫療器械有限公司；UV-2802 紫外可見分光光度計：尤尼柯（上海）儀器有限公司；LDZX-5OFAS 立式壓力蒸汽滅菌鍋：上海申安醫療器械廠；xMark 酶標儀：BIO-RAD 公司；SW-CJ-2FD 型潔凈工作臺：蘇州安泰空氣技術有限公司；YHG-型搖床：上海欣蕊自動設備有限公司。

2 試驗方法

2.1 培養基配置

參照Saritha 等的方法配置馬鈴薯葡萄糖瓊脂（potato dextrose agar，PDA）平板和斜面培養基[7]：馬鈴薯200 g，葡萄糖 20 g，瓊脂 15 g，蒸餾水 1 000 mL，pH7。

參照張靜靜方法配置CMC-Na 篩選培養基[8]：CMC-Na 5 g，牛肉浸膏1 g，蛋白胨1 g，MgSO40.5 g，KH2PO31 g，K2HPO31 g，瓊脂 20 g，水 1 000 mL，pH7，121 ℃滅菌 20 min。

應用 Biochof 等的產酶培養基[9]：CMC-Na 5 g，酵母膏 2g，MgSO45g，水 1000mL，pH7。每個培養瓶 250mL。

2.2 樣品處理

將原始森林腐爛木材下的土壤樣品梯度稀釋，各取10-4～10-63 個稀釋度0.1 mL 涂布以CMC-Na 為唯一碳源的篩選平板，37 ℃倒置培養72 h，分離旺盛生長的菌株。

2.3 剛果紅染色鑒定法

采用張煒煒剛果紅染色鑒定法[10]，將所分離的菌株活化后，點樣接種于篩選培養基CMC-Na 平板并做好標記，倒置培養72 h，加入適量1 mg/mL 剛果紅溶液，染色3 h 后棄去染液，加入適量1 mol/L NaCl 溶液脫色1 h。根據透明圈大小及透明圈菌落直徑比選擇產酶菌株。

2.4 接種和產酶培養

將平板上的單菌落挑起，在斜面培養基上劃線純化培養。每天觀察，待菌種長后，用10 mL 生理鹽水洗下制成孢子液或單細胞菌懸液（部分留作甘油種），取1 mL轉入產酶液體培養基，30 ℃培養，100 r/min，培養3 d。

2.5 粗酶液的制備

應用何海燕等的粗酶液的制備方法[11]，取1 mL 孢子懸液或單細胞菌懸液轉入產酶液體培養基，30 ℃培養，100 r/min，培養3 d，將纖維素酶發酵液用6 層紗布過濾，4 000 r/min，離心10 min，上清液即為粗酶液。

2.6 纖維素酶酶活性檢測

參照盧憲芹配制葡萄糖標準液[12]：將葡萄糖放在110 ℃烘箱中烘2 h 至恒重，稱取0.108 g 葡萄糖，用蒸餾水溶解定容至100 mL 制成6 μmol/mL 的葡萄糖標準液。

取6 支洗凈烘干的20 mL 具塞刻度試管，編號后分別加入 1 mg/mL 的葡萄糖標準溶液 0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，補加蒸餾水至總體積為2 mL，配制成一系列不同濃度的葡萄糖溶液。充分搖勻后，向各試管中加入2 mL DNS 溶液，搖勻后沸水浴5 min，取出冷至25 ℃后，用蒸餾水定容至20 mL，充分混勻。在540 nm波長下，以1 號試管溶液作為空白對照，調零點，測定其它各管溶液的光密度值并記錄結果。以葡萄糖含量（mg）為橫坐標，OD 值為縱坐標，繪制標準曲線。計測出其在540 nm 處的吸光度，得出還原糖的量。

參照宋嶸錫的羧甲基纖維素酶活力（CMCase）的測定方法[13]：取4 支洗干凈烘干的試管，編號后，取1%的 CMC-Na 溶液 3.8 mL（CMC-Na 溶于 pH 值為 4.8 的醋酸緩沖液）作為底物，同時一號試管加入3.8 mL 蒸餾水作為空白對照組，50 ℃保溫酶解反應30 min，加入經稀釋10 倍的粗酶液0.2 mL，于50 ℃反應30 min，加入1 mL DNS，1 mL 2 mol/L NaOH，沸水浴10 min，冷卻后加水稀釋到25 mL，于540 nm 測定還原糖量。以1 號試管溶液為空白對照調零點，在540 nm 波長下測定2、3、4 號試管液的吸光度值并記錄結果。根據3 個重復光密度的平均值，在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量，計算出CMC 酶活力。

2.7 菌落形態觀察

通過對平板生長菌落的形態、大小、顏色、菌絲及孢子的觀察對菌落進行初步鑒定。

2.8 顯微觀察

參照高鴻健插片法[14]：用鑷子把滅過菌的蓋玻片斜插入涂布接種的PDA 平板培養基上，每塊板插3片～5 片，培養3 d～5 d，可以在不同生長期小心取出蓋玻片，在顯微鏡下觀察菌絲、分生孢子梗、孢子的形態。

2.9 分子鑒定

菌體總DNA 的提取：新鮮培養的菌絲加入液氮，在研缽中充分研磨變成粉末，總DNA 的提取參照Michaelson 等方法進行[15]。總 DNA 純化晾干后加 100 μL TE 緩沖液（pH7.4）充分溶解后在-20 ℃下保存備用。

聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）擴展5.8S 核糖體內轉錄區域DNA 序列（internally transcribed spacer regions and the ribosomal，ITS） 鑒定菌種：PCR 引物按 White 等報道設計[16]，引物 ITS1 的序列：5`TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3`，引物 ITS4 的序列：5`TCCTCCGCTTATTGATATGC3`。PCR 擴增體系為：10×Ex Taq 緩沖液 5 μL，菌體總 DNA 2 ng，10 mmol/L dNTP 1 μL，20μmol/L ITS1 引物 0.5 μL，20μmol/L ITS4引物0.5μL，TaqTM聚合酶2U，加去離子水補足至50μL。

PCR 反應條件為：95 ℃預變性 5 min，95 ℃ 50 s，52 ℃ 40 s，72 ℃ 50 s，30 個循環后 72 ℃延伸 10 min。PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳，用PCR 純化試劑盒回收純化PCR 產物，對ITS 基因片段測序，利用BLAST 軟件在NCBI 進行同源性比較。檢索得到的同源性較高的序列用Vector NTI 軟件整理排列，用分子進化遺傳分析軟件MEGA7，neighbor joining method 構建系統發生樹。

3 結果與分析

3.1 產纖維素酶細菌的篩選

樣品經富集之后，在篩選培養基上共篩選出12 株長勢良好的菌株，經篩選培養基原位多次點種剛果紅染色鑒定，有4 個菌落周圍均有透明圈，2 號菌株產生的透明圈大而清晰，直徑可達21 mm，將此菌株命名為H-2。

3.2 菌株的酶活測定結果

根據葡萄糖標準溶液光密度測定結果，繪制葡萄糖標準曲線，見圖1。

圖1 葡萄糖標準曲線Fig.1 Standard curve of glucose concentration

H-2 液體培養3 d，測定粗酶活性，在標準曲線上查出對應的葡萄糖含量，計算出CMC 酶活為130 U/mL。試驗結果表明，H-2 菌株分泌CMC 酶的能力較強，有進一步研究開發的價值。

3.3 菌株的形態和顯微鑒定

H-2 菌株在PDA 平板上培養4 d 后的生長情況見圖2。

圖2 H-2 菌株在PDA 平板上培養4 d 后的生長情況Fig.2 Growth of H-2 strain cultured on PDA plate for 4 days

H-2 菌落在PDA 平板上形成由中心向外3 層的菌圈，菌落中心為黃白色油狀滴，往外為藍紫色圈，菌落為絲狀菌絲，最外層為較大的白色絨狀圈，在PDA培養基生長3 d 直徑可達3 cm。

H-2 菌株剛果紅染色產生的透明圈見圖3。

圖3 H-2 菌株剛果紅染色產生的透明圈Fig.3 H-2 produced clear hydrolytic zone around its colony on a Congo red dyeing agar plate

H-2 菌在CMC-Na 上培養3 d，經剛果紅染色出現較大透明圈，直徑達2 cm～3 cm。

H-2 菌株的光學顯微鏡圖見圖4。

圖4 光學顯微鏡圖Fig.4 Optical microscope

利用插片法在光學顯微鏡下觀察，H-2 菌絲有分枝，且有橫隔，分生孢子梗聚集，呈條狀，表面光滑，顯綠色。

H-2 掃描電子顯微鏡相片見圖5。近端處分枝，孢子絲發育到一定階段便分化為分生孢子，孢子橢圓形，孢子囊絲狀有隔膜，孢子橢圓形。孢子囊相互連接。H-2 菌株菌落形態特征、顯微特征都和霉菌屬菌株一致，依據魏景超方法初步推斷為霉菌屬菌株[17]。

圖5 H-2 掃描電子顯微鏡相片Fig.5 The scanning electron micrograph of H-2

3.4 菌種分子鑒定

H-2 系統進化樹見圖6。

圖6 H-2 系統進化樹Fig.6 Phylogenetic tree of H-2

依據Bruns 等和Gardes 等方法，ITS 序列在相同物種之間高度同源，是物種鑒定的可信的基因標記[18-19]。PCR 成功擴增得到 02 菌株 ITS 序列 752bp，BLAST 比對，以比對得到的相近ITS 序列建立進化樹。02 系統進化樹顯示，02 菌株和刺器腐霉 （Pythium acanthophoron）處于進化樹同一分支上，兩者ITS 位點序列有100%的相似性，表明該菌株和刺器腐霉（P.acanthophoron）分類地位很接近，有很近的親緣關系。

4 結論

原始森林土壤中蘊含豐富微生物菌種資源，從原始森林取樣可以篩選得到酶學性質優良的菌種。從廣西羅城原始森林取樣篩選到4 株產纖維素酶菌株，其中經剛果紅染色法證明H-2 在CMC-Na 篩選平板上形成的透明圈和菌落直徑最大，產羧甲基纖維素酶的能力強，液體發酵粗酶活測定發現，H-2 菌株液體發酵培養3 d，羧甲基纖維素酶活力達130 U/mL。H-2 菌落形態及顯微形態特征鑒定為細菌桿菌屬菌株，羧甲基纖維素酶活較高，具有良好的應用前景。

研究表明，腐霉屬（Pythium Pringsheim）可以產纖維素酶[20-22]，但未見刺器腐霉（P.acanthophoron）產纖維素酶報道。課題計劃繼續開展刺器腐霉發酵條件優化、纖維素酶純化及酶學特性研究，為該菌進一步運用打下試驗基礎。