醬香型白酒的輪次酒以及“二次制曲”過程中的風味物質分析

戴奕杰，李宗軍，田志強，楊金川

（1.湖南農業大學食品科技學院，湖南長沙410128；2.貴州省產品質量監督檢驗院，貴州貴陽550016）

中國白酒風味物質的形成現已發現是美拉德反應和存在于大曲、酒醅和窖泥中的微生物及其酶的催化反應之間的相互重疊作用的結果。醬香型酒用的高溫曲以小麥為原料，其本身含有大量的酶和蛋白質，制曲過程淀粉轉化為糖，蛋白質分解成氨基酸，加上堆積發酵的高熱能條件下氨基酸和還原型單糖發生美拉德反應生成醬香物質，主要成分為醛、酮類和吡嗪類化合物，還有氨基酸脫氨脫羧反應形成許多的高級醇，都是醬酒香味的前體物質[1]。隨著研究的深入和檢測手段的改進，人們又提出了吡嗪類[2-5]、呋喃類和吡喃類衍生物[6-8]、高沸點酸性物質和低沸點酯類物質的復合香氣是醬香型白酒的主體香的觀點[6，9-17]。但是，至今醬香型白酒主體香仍沒有一個明確的結論。

目前，關于醬香型白酒特征香味的產生主要涉及兩個方面，非酶褐變反應和酶法褐變反應，前者以“美拉德反應”為主要研究方向[1，18-19]，后者是由多酚的氧化反應引起的[20-21]。由于醬香酒的香味成分種類多樣，關系復雜，其間的量比諧調關系對醬香風味影響較大，只有在適量的前堤下，才能對酒質起到較好的作用，一但打破應有的動態平衡體系，就會給酒體帶來負面影響。因此，進一步地深化醬香白酒的關鍵香味及形成機制，對建立改善醬香白酒品質的方法提供理論依據。但是由于醬香酒生產工藝特殊，使得成分復雜且關鍵風味物質很難分析，是行業內迫切攻破的難關。另外，氣相色譜、液相色譜、氣質聯用分析等新技術的出現，為曲酒香味成分分析提供了利器。

本文利用氣相色譜（gas chromatography，GC）技術對七輪次酒和堆積發酵階段各酒醅樣本的部分風味物質進行定量檢測，進一步加深對醬香型白酒風味物質形成機制的認識和理解。與此同時，將結合酒醅微生物群落結構特征、酶系變化規律、理化性質等進行綜合分析，探究影響醬酒酒質的主要因素，為將來進行功能微生物菌屬鑒定及改善曲酒生產工藝提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 酒醅采樣

按照傳統醬酒的釀造工藝，在貴州某酒廠釀造過程中進行采樣。跟蹤生產車間中某一口窖池，對其整個醬香白酒生產發酵工序進行取樣。酒醅樣本的取樣從下沙、造沙和七輪次發酵過程的高溫堆積、窖池發酵工序中進行固定點位的采取，取樣方法為：對高溫堆積和窖池發酵酒醅的上、中、下層進行取樣，各層面進行3 個重復，共9 個抽樣點。將上述采樣位點的樣品破碎并混勻后，分裝于無菌袋封裝標記，凍冷保存。樣本信息如表1 所示。

表1 酒醅樣本采集信息表Table 1 Acquistion information table of fermented grains

1.1.2 輪次酒取樣

按1.1.1 的取樣步驟，在跟蹤對酒醅取樣的同時，對相應生產輪次所產的輪次酒進行采樣。具體方法為選取500 mL 密閉容量瓶分別對7 個輪次酒熟糟上甄蒸酒取酒，取樣量為每個輪次500 mL，酒樣放于避光陰涼處進行貯存以備檢測。樣本信息如表2 所示。

1.2 儀器與設備

7890A 氣相色譜儀（配 FID）：美國 Agilent 公司；Agilent HP-INNOWAX（60 m×0.250 mm×0.25 μm）：美國Agilent 公司；Cleanert EC 堿性硅藻土固相萃取柱（填料4 000 mg 柱容量12 mL）：博納艾杰爾科技。

1.3 試驗方法

1.3.1 試劑標準液及樣品預處理

1.3.1.1 試劑標準液配制

將 950 μL 60%乙醇及 50 μL（20 g/L 標液）混勻，對此標準儲備液進行稀釋，濃度梯度分別為0.05、0.1、0.2、0.5、1.0 g/L。

1.3.1.2 酒醅樣品前處理

酒醅和大曲樣本各取10 g，分別與10 mL 60%乙醇混合，振蕩40 min 后，5 000 r/min 冷凍離心10 min，過濾膜后上機。

取10 g 酒醅樣品放入用封口膜包好的三角瓶中，同時加入20 mL 的去離子水，混勻，靜置30 min 后，吸取8 mL 混合物于裝有3 g 氯化鈉與磁石的20 mL 頂空瓶中，放置磁力攪拌器上攪拌15 min 后，將項空瓶置于50 ℃水浴鍋中恒溫萃取45 min，萃取完畢后將萃取頭取出，插入氣相色譜進樣口熱解析6 min，用于氣相色譜分析。

1.3.2 醬香型白酒香氣化合物的含量檢測

1.3.2.1 色譜條件

載氣氮氣，流速1 mL/min；進樣口溫度：230 ℃；柱溫：起始溫度 40 ℃（8 min），以 5 ℃/min 速率升至 70 ℃（5 min），再以 10 ℃/min 速率升至 180 ℃（10 min），最后以20℃/min 升至240℃（7min）；分流比：20 ∶1；檢測器溫度：250 ℃，氫氣流速：40 mL/min；空氣流速：200 mL/min。

1.3.2.2 數據統計分析

本文利用R 語言對各數據集進行標準差計算，標準差描述各數據偏離平均數的距離（離均差）的平均數，它是離差平方和平均后的方根，用s 表示。標準差是方差的算術平方根。標準差能反映一個數據集的離散程度，標準偏差越小，這些值偏離平均值就越少，反之亦然。其計算公式見圖1。

圖1 標準差計算公式Fig.1 Formula for calculating standard deviation

2 結果與分析

2.1 輪次酒風味物質檢測

輪次酒中風味物質成分檢測結果見表3。

表3 輪次酒中風味物質成分檢測Table 3 Component testing of flavor characteristics in rounds wine g/L

續表3 輪次酒中風味物質成分檢測Continue table 3 Component testing of flavor characteristics in rounds wine g/L

從表3 可以看出來，7 個輪次的新酒中檢測出醇、酯、醛、酸類物質，種類共計38 種，其中醇類14 種、酯類14 種、醛類4 種、酸類6 種。含量最高的為正丙醇，在一輪次酒中可達6.76 g/L，并且在前6 個輪次酒中均保持著較高的含量。含量最低的為苯甲酸乙酯、2-苯基乙酸乙酯，在一輪次酒中均只有0.01 g/L，并且在7個輪次酒中均處于低含量水平。觀察整個試驗數據，大體上多數物質均在中間輪次（三、四、五輪次）中維持著較高含量，這為中間輪次產優質基酒提供了重要的物質前提。輪次酒中各物質含量及種類偏少，需要再進一步按照醬香白酒儲存要求進行多年的儲存后才可生成豐富的醬香風味物質體系。

2.1.1 醇類物質

由表3 數據可以看出，醇類物質中以正丙醇的含量最高，其他醇類均處于較低的含量水平，整體含量最低的為苯乙醇。其中2-丁醇、2-戊醇、1-己醇在一輪次酒中未檢出，從第二輪次中方才檢出，2-丁醇在七輪次酒中未檢出。已有研究報道，正丙醇是醬香白酒中檢測含量較高的一類醇，同時其也是形成酒體爽口的重要物質保證。另外，醇類相對于其他成分沸點較低，因此容易揮發，并可帶著其他物質一起揮發，從而起到助香的作用。

2.1.2 酯類物質

中國白酒中四大主要酯類物質為己酸乙酯、乳酸乙酯、乙酸乙酯、丁酸乙酯，在試驗的7 個輪次酒樣中均有檢出，其中以乳酸乙酯及乙酸乙酯的含量最高，乳酸乙酯在二輪次酒中可達到2.98 g/L，乙酸乙酯在一輪次酒中可達到2.85 g/L。酯類物質是組成白酒獨特風格的重要化合物，其在酒體中主要可以表現出微甜、帶澀，并還可以體現出一定的苦味和刺激感。

2.1.3 有機酸類

有機酸類物質是醬香白酒中重要的風味物質組分。試驗樣酒中共檢出有機酸類6 種，含量最高的為乙酸，在第二輪次酒中可達到1.48 g/L，且在各輪次酒中均維持較高水平含量。含量較低的為異丁酸，在第五輪次酒中達到低值0.02 g/L。三甲基丁酸在第一、二輪次酒中沒有檢出，其他酸均在各輪次中檢出。酸類物質在醬香白酒中的作用為催化酒體老熟，有機酸所釋放出來的H+可以在各物質中間發生氫鍵締合作用，使酒體趨于醇厚、綿柔，另一方面有機酸也可以增強酒體后味，其中一些高沸點的有機酸還可以提升白酒的豐滿度和醇和度，消除白酒的糙辣感。

2.1.4 醛類物質

醛類物質在白酒中含量不高，此次試驗在樣酒中共檢出4 種醛類物質，常見的乙醛和乙縮醛均有檢出，乙醛含量較高，在第五輪次酒樣中可達到2.31 g/L，而乙縮醛始終處于較低的含量水平。醛類物質主要是糖轉化為乙醇過程中的中間產物，也可由氨基酸分解代謝產生。普遍認為醛類物質含量過高對于酒體口感不利，認為生產中的操作不當及衛生條件不好，會導致糖化不良、醅糟染菌，最終造成糠醛、甘油醛和丙烯醛的產生，達到一定量時會給酒體帶來明顯的糙辣味。因此，實際生產釀造中要嚴把工藝質量關，控制醛類物質的產生，保證酒質。各類物質總量對比見表4。

由表4 可知，4 類物質的總體趨勢均為在第四、五輪次中維持較高含量，后在第六、七輪次中下浮較大。其中以醇類物質的總量最高，在第四輪次中達到15.50 g/L，其次為酯類物質，在前5 輪次期間其含量在5.85 g/L～6.9 g/L 區間進行上下浮動變化。酸類物質含量在7 個輪次中變化幅度最小，最高值也只是在第三輪次中的2.09 g/L。總體來說，輪次新酒中的物質含量及種類均不如儲存后的基酒或成品酒中豐富，原因就在于后期的長達3 年～5 年的存放過程，漫長的儲存期可以使得酒體中物質種類更加豐富，以醇、酯、醛、酸類物質為基礎，進一步發生化合反應，最終締合成醬香風味物質，同時也使得酒體更趨于醇厚、協調。

表4 各類物質總量對比Table 4 Total content comparison g/L

2.2 醬香型白酒酒醅發酵過程中風味物質檢測

醬香白酒釀造工序中醇類物質的分析檢測結果見表5。

表5 醬香白酒釀造工序中醇類物質的分析檢測Table 5 Alcohol analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

如表5 所示，共檢測出的醇類物質有14 種，其中在下沙和糙沙階段大多數醇類物質沒有檢出，只有1-辛醇是從下沙階段即可檢出的，另異戊醇在糙沙堆積階段開始有所檢出。在一輪次起窖時，多數醇類物質可被檢測出，但與后面輪次比較，仍有2-丁醇、正丁醇、異戊醇、3-辛醇、2-辛醇、1-己醇未被檢出，之后幾乎在每個輪次中均能檢出14 種醇類物質。多數醇類物質含量處于“兩頭低、中間高”的變化趨勢，先是逐漸上升，到達最高值后維持一段時間又開始下降，此類物質有2-丁醇、異丁醇、2-戊醇、正丁醇、異戊醇、1-戊醇、3-辛醇、2-辛醇、2-糠醛，變化幅度最大的為異戊醇，從糙沙堆積階段的0.05 g/kg 醅上升至四輪次起窖時的1.40 g/kg 醅，增加幅度達到30 倍。有些物質變化幅度較小，處于較為平穩的狀態，有甲醇、1-辛醇、1-己醇、苯乙醇，基本都是處于2 倍～3 倍的變化幅度，且整體含量較低。其中在含量上以苯乙醇的變化幅度最小，在0.02 g/kg～0.03 g/kg 醅之間，且從數值上看，苯乙醇也是所有醇類物質中各輪次含量最低的。正丙醇含量最高，在一輪次起窖時即達到了7.11 g/kg 醅，之后處于下降趨勢，但在各輪次中均是含量最高，從六輪次起窖時即開始快速下降，直至六輪次下窖時達到最低值0.28 g/kg 醅，下降幅度達到25 倍。與輪次酒相比，各輪次起窖時糟醅中所含醇類物質從種類和含量上來看均較為高效地被提取入酒體中，成為輪次酒中關鍵組分。醬香白酒釀造工序中酯類物質的分析檢測見表6。

表6 醬香白酒釀造工序中酯類物質的分析檢測Table 6 Estersl analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

如表6 數據所示，酯類物質在釀造工序中可檢測出的為14 種，其中白酒重要的四大酯——己酸乙酯、乙酸乙酯、乳酸乙酯、丁酸乙酯均有檢出。在下沙和糙沙階段可檢出的酯類很少，只有到糙沙起窖階段才有少量的乙酸乙酯及乳酸乙酯被檢出，其他酯類均是在一輪次起窖時才被檢出。含量最高的為乙酸乙酯，其從糙沙起窖時的0.06 g/kg 醅一直上升至五輪次起窖時的3.78 g/kg 醅，其次為乳酸乙酯，在第三輪次起窖時可達到0.81 g/kg 醅，含量最低的為2-苯基乙酸乙酯，在七輪次起窖時僅僅只有0.01 g/kg 醅。部分酯類依然遵循著先上升后下降的趨勢，在中間輪次（三、四、五輪次）達到最大含量值，有乙酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯，其中乙酸乙酯、丁酸乙酯、異戊酸乙酯、己酸乙酯、己酸丙酯為第四、五輪次達到含量最大，只有戊酸乙酯是在第三、四輪次到達最高含量，其余酯類物質無明顯的變化規律。可以看出，在酒質較好的中間輪次中，四大酯中有3 種是達到了其釀造過程中的最高含量，且四大酯的含量總體上明顯高于其他酯類。醬香白酒釀造工序中酸類物質的分析檢測見表7。

表7 醬香白酒釀造工序中酸類物質的分析檢測Table 7 Acid analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

由表7 看出，從釀造工序中共檢出酸類物質共6種，其中乙酸、丙酸、異丁酸從下沙階段即可檢出，丁酸、己酸在一輪次起窖階段可檢出，唯獨三甲基丁酸直到二輪次下窖時才有檢出。其中乙酸含量最高，在下沙階段即有較高值1.83 g/kg 醅，后小幅下降又有回升直至三輪次起窖時達到最高值2.37 g/kg 醅，含量最低的為三甲基丁酸，在0.03 g/kg～0.07 g/kg 醅范圍內變化。乙酸、異丁酸、己酸均符合先上升后下降的趨勢，其中異丁酸在二輪次起窖時即達到最高值0.35 g/kg 醅，后直到七輪次時都處于較高的含量。丙酸在下沙階段即達到了0.79 g/kg 醅，后在糙沙階段迅速下降至0.22 g/kg 醅，再小幅上升至四輪次起窖時達到中期最高值0.53 g/kg醅，整體上變化幅度較小。酸類物質從含量上看在整個釀造工序期間均變化幅度較小，著也為醬香風味的形成提供了穩定的物質保證。香白酒釀造工序中醛類物質的分析檢測見表8。

表8 醬香白酒釀造工序中醛類物質的分析檢測Table 8 Aldehydes analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

表8 醬香白酒釀造工序中醛類物質的分析檢測Table 8 Aldehydes analysis and detection during Maotai-flavored baijiu fermentation process g/kg

如表8 所示，醛類物質是可檢出的物質中數量最少的，只有4 種。乙醛、乙縮醛在下沙和糙沙階段均無檢出，只有到一輪次起窖時才有檢出，糠醛則是到一輪次下窖時才檢出。5-甲基糠醛從下沙堆積階段即可檢出。4 種醛類物質含量大體上符合先上升后下降的趨勢，總體含量較高的為糠醛，在五輪次起窖時即達到2.34 g/kg 醅，含量較低的為乙縮醛，一輪次起窖時檢出含量為0.07 g/kg 醅，后經過小幅的上升直至六輪次起窖時達到最高值0.26 g/kg 醅。乙醛在初始檢出的含量僅為0.18 g/kg 醅，后隨著釀造過程的繼續，直至五輪次起窖時含量上升10 倍達到最高值1.75 g/kg醅。5-甲基糠醛在下沙堆積階段僅檢出含量為0.26 g/kg醅，其后有大幅的上升直至一輪次起窖時達到1.33 g/kg醅，從一輪次開始，5-甲基糠醛的檢出含量就一直維持在較高的數值（大于或接近于1 g/kg 醅），直至七輪次起窖。四類物質總量隨釀造工序變化見圖2。

由圖2 可以看出，總體上醇類物質含量遠遠高于其他3 類物質，含量上有規律：醇>酯>醛>酸。酯類物質在下沙階段沒有檢出，其他3 類物質從下沙開始均有存在。醇類物質總量在一輪次起窖時即達到高值7.98 g/kg 醅，后又不斷攀升，直至第三、四輪次期間均維持在>11 g/kg 醅的高值。酯類物質的種類雖然與醇類一樣多，但其總量卻遠遠低于前者，雖然也明顯高于醛類與酸類，但只是小幅度地高于兩者。酯類物質含量自糙沙階段的0.14 g/kg 醅開始，至第四、五輪次達到最高值6.88 g/kg 醅。醛類物質雖然比酸類少兩種，但其總量略高于酸類，由下沙階段的最低值0.26 g/kg 醅一直上升至第四、五輪次達到最高5.50 g/kg 醅。酸類物質含量總體上最低，最高值出現在三輪次起窖時3.42 g/kg 醅。四類物質仍是在中間輪次時保持著較高的含量，這為中間輪次酒的酒質提供了豐富的物質保證。而在七輪次時，相對于下沙初始，均還保持著一定含量，但七輪次的酒質已經處于較差的狀態，并且糙沙起窖時的含量處于較低的水平。這也從側面證明了對于醬香白酒的釀造，其中各物質含量偏低的話無法為酒體風味形成提供物質基礎，只有達到一定含量后才能使得量變發生質變，方能影響到酒質的形成，所以推測醬香白酒釀造過程中各類物質含量及其比例是形成醬香風味的關鍵前提所在。

圖2 四類物質總量隨釀造工序變化Fig.2 Total content variation of the four types of materials during fermentation process

3 結論

范文來等[22]在文獻中提到，生產試驗發現，醬香型白酒的第一、第二輪次酒偏清甜，第三、第四、第五、第六輪次主要產醇甜和窖面醬香型酒，并且全面總結了醬香酒風味物質的特征和形成途徑。醬香型白酒風味種類繁多，在化學鍵、分子間力等作用下，風味物質間相互聚合，形成了復和、獨特的風味[23]。本研究從堆積發酵過程中，采集酒醅和輪次酒樣本，檢測其中存在的微量成分及其含量，以期總結出醬香型白酒的風味特性。

1）輪次酒：醇類含量最高的是正丙醇，該物質可影響白酒口感，總體隨著發酵工序的進行，后面輪次酒中的正丙醇含量降低；各輪次酒中均檢出種類豐富的酯類物質，其中是以乙酸乙酯的相對含量最高，豐富的酯類構成醬香型白酒的重要香氣組分，隨輪次酒的增加先升后降。有機酸中含量最高為乙酸，乙酸是乳酸菌以葡萄糖所分解的乳酸為底物產生，同時生成乙醇和二氧化碳及其他有機酸類，而乙酸又是形成乙酸乙酯的前體物質。醛類物質以乙醛含量較高，醛類作為中間產物影響酒質，醛類除糠醛外其他研究較少。總體趨勢均表現在第三、第四、第五輪次酒中維持較高的含量，為優質基酒的產出提供物質前提。醇類物質起主導，形成各輪次酒的典型符合醬香風味。

2）酒醅：醇類物質總體上呈現先上升后下降的趨勢，依舊是正丙醇含量最高，起窖高，下窖低。含量最高為乙酸乙酯，其次為乳酸乙酯呈現先升后降趨勢，且中間輪次達到最高值，乳酸菌和梭桿菌屬對醬香型白酒風味形成和口感密切相關，表現為Escherichia-Shigella 和乳桿菌在發酵中期，起窖時豐度高；芽孢桿菌還在窖泥中能代謝產生酯類物質，同時分泌脂肪酶和產生有機酸，堆積下窖時的脂肪酶活性高，Clostridium-sensu-stricto-1 在中期的含量也表現相同的規律。酸類變化幅度較小，乙酸含量最高。醇、酸、酯類物質在窖池發酵的含量高于堆積發酵階段，說明高溫堆積將部分前體物質帶到窖內進行分解，并在酒體中高效提取，成為輪次酒中的關鍵組分。有機酸與醇類物質酯化產生酯類，因此醋酸菌和乳酸菌對酯類形成起重要作用。醛類物質整體變化趨勢為逐漸上升再下降?？啡┑目傮w含量高，5-甲基糠醛前期下降，后期上升。中間輪次酒保持較高含量，為酒質提供豐富的物質保證。