人子宮內膜干細胞移植對FSGS大鼠腎組織中TNF-α和IL-6表達水平的影響

唐玥雯 楊汝春* 萬鳳 張華琴 王軍 林宜

局灶節段性腎小球硬化（Focal and segmental glomerulosclerosis，FSGS）是一類常見的原發性腎小球疾病，其治療困難且預后較差，是導致終末期腎功能衰竭（End-stage renal disease，ESRD）的主要原因之一［1-2］。前期研究發現骨髓間充質干細胞可通過抑制腎臟炎癥因子的表達來緩解腎臟局灶節段性腎小球硬化［3］。而子宮內膜干細胞（MenSC）是一群來源廣泛，具有自我更新、多向分化和高度增殖潛能的干細胞，有望成為良好的移植細胞源［4］。2017年1月至2019年3月作者通過實驗研究，探討MenSC移植對緩解FSGS大鼠進程的影響，及其對腎組織炎癥因子TNF-α和IL-6表達的影響。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器 阿霉素（浙江海正藥業股份有限公司，批號：040505）；氯胺酮（福建古田藥業有限公司）；DMEM培養基（Gibco）；胎牛血清（Gibco）；兔抗大鼠TNF-α抗體和兔抗大鼠IL-6抗體，購于武漢博士德生物工程有限公司；0.25%胰蛋白酶-EDTA、山羊血清、羊抗兔HRP二抗、DAB顯色液及抗原修復液（上海邁新生物技術有限公司）；SYBR? Premix Ex TaqTM、ROX Reference Dye（50×）、引物設計及合成等均自TaKaRa公司。日立7180型全自動生化分析儀（日本株式會社日本高新技術）；Real-time PCR儀（ABI 7500）；低溫低速離心機（Heraeus，LEGENTRT，德國）；制冰機（Scotsman，AF100，意大利）。

1.2 實驗動物與細胞 大鼠選用3周齡雌性，體重160～180g，清潔級SD大鼠，大鼠購自浙江中醫藥大學實驗動物中心。動物質量合格證號為SCXK（滬）2007-0005。飼養條件：恒溫，溫度20±1℃，濕度50%～60%，光照每12h明暗交替，通風8～15次/h。實驗飼養室許可證號：SYXK（浙）2003-0003。MenSC購于杭州易文賽生物技術有限公司子宮內膜干細胞庫，是從健康成年女性月經血中分離得到的一種新來源的間充質干細胞。

1.3 方法 （1）細胞培養：用含15%胎牛血清的DMEM培養基培養MenSC細胞，置于含5% CO2的37℃培養箱中進行孵育。當細胞生長至80%～90%融合時，采用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化，按1∶3的比例進行傳代。（2）FSGS大鼠模型建立：將健康雌性SD大鼠稱重后隨機分為正常組、模型組和移植組，每組各6只。模型組及移植組大鼠先采用50mg/kg氯胺酮腹腔注射，待其麻醉后行左腎摘除術，術后第7、28天分別尾靜脈注射5mg/kg和2mg/kg阿霉素。正常組大鼠麻醉后行假手術，術后同時間內以等量生理鹽水進行尾靜脈注射。（3）細胞移植：用胰酶消化生長狀態良好的P3～P5代MenSC，用PBS重懸后調整細胞密度至1×107/ml。移植組于術后第28天尾靜脈注射MenSC細胞懸液1ml；正常對照組大鼠不作任何處理，模型組大鼠注射等量PBS作為對照。（4）血液和尿液標本的收集及測定：實驗結束前，使用代謝籠法收集24h尿量，量取尿量，用生化儀常規測定尿蛋白，結合尿量計算24h尿蛋白；在術后8周末氯胺酮麻醉大鼠，腹主動脈取血，離心后收集上層血清，生化儀測定血肌酐、尿素氮、血漿白蛋白等指標。（5）Real-time：PCR擴增：Trizol提取大鼠腎臟總RNA，取約2μg總RNA逆轉錄成cDNA，并進行real-time熒光定量PCR，采用GAPDH作為內參。TNF-α上游引物序列5'-GGCGTGTTCATCCGTTCT-3'，下游引物序列5'-CCACTACTTCAGCGTCTCG-3'，PCR擴增片段201bp；IL-6上游引物序列5'-CCTTCTTGGGACTGATGT-3'， 下 游 引 物序 列 5'-TCCAGGTAGAAACGGAAC-3'，PCR擴增片段267bp；GAPDH上游引物序列5'-ACCACAGTCCATGCCATCAC-3'，下游引物序列5'-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3'，PCR 擴 增 片 段453bp。PCR反應體系為：SYBR Premix Ex Taq（2×）10μl，上下游引物各 0.4μl，ROX Reference Dye（50×）0.4μl，DNA 模 板 2.0μl，ddH2O 6.8μl。 于 ABI PRISM 7500熒光定量PCR擴增儀上進行反應，擴增條件為：95℃預變性30s，繼以95℃ 5s，60℃ 31s共40個循環，數據以2-△△Ct表示。（6）免疫組化檢測腎組織中TNF-α和IL-6表達：處死大鼠后，取出部分腎組織，經固定、脫水、透明、浸蠟、包埋后制成3μm厚的石蠟切片。免疫組化檢測腎組織中TNF-α和IL-6表達的步驟如下：切片脫蠟、水化、抗原修復、PBS洗滌、胰蛋白酶消化、PBS清洗，5%山羊血清封閉30min后加入兔抗大鼠一抗（TNF-α 1∶50；IL-61∶100），置于4℃冰箱中過夜；PBS洗滌后加增強劑，37℃放置30min，然后滴加羊抗兔HRP二抗，37℃放置45min；清水沖洗3次后DAB顯色至棕黃色陽性信號出現，清水阻斷，洗3～4次后蘇木素復染，脫水晾干封片。采用ImagePro plus6.0圖像采集及分析系統，每張切片（×400）光鏡下隨機采集5個不重疊視野，測量棕黃色陽性染色平均積分光密度（Integral Optical Density，IOD），取平均值作為每例切片的平均IOD。

1.4 統計學方法 采用SPSS 20.0統計軟件。計量資料用（s）表示，方差齊者，多組間采用one-way ANOVA檢驗，組間兩兩比較用LSD檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 MenSC移植對FSGS大鼠24h尿蛋白的影響 見表1。

表1 MenSC移植對FSGS大鼠24h尿蛋白水平的影響（s）

表1 MenSC移植對FSGS大鼠24h尿蛋白水平的影響（s）

注：與模型組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

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2.2 MenSC移植對FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影響 見表2。

表2 MenSC移植對FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影響（s）

表2 MenSC移植對FSGS大鼠血肌酐、尿素氮和白蛋白的影響（s）

注：與模型組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

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2.3 MenSC移植對FSGS大鼠TNF-α和IL-6轉錄水平表達的影響 見圖1。

圖1 RT-PCR法檢測大鼠腎組織TNF-α和IL-6的基因表達（n=6）

2.4 MenSC移植對FSGS大鼠TNF-α和IL-6蛋白水平表達的影響 見圖2、表3。

圖2 免疫組化染色檢測各組大鼠腎組織TNF-α 和IL-6的表達（IHC，×400）

表3 半定量分析免疫組化中腎組織TNF-α和IL-6表達（s）

表3 半定量分析免疫組化中腎組織TNF-α和IL-6表達（s）

注：與模型組比較，* P＜0.05，** P＜0.01

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3 討論

FSGS是由多病因導致的、以腎小球節段硬化為病理特征的一種疾病，是一種常見的、極易進展為ESRD的腎小球疾病［5-6］。然而，目前對FSGS的治療主要依賴于激素和免疫抑制劑，這些只能從某種程度上延緩其發展。因此，亟待尋找一種安全、有效，能從根本上控制甚至逆轉FSGS 病程進展的方法。

干細胞自我更新和分化為各種細胞的潛能及免疫調節作用，為FSGS的治療開辟新的希望。已有研究證明人臍帶血來源干細胞移植可緩解FSGS大鼠腎小球硬化的進展，降低血清中IL-6和TNF-α的表達［7］。MenSC是一類存在于子宮內膜基底層的成體干細胞，不僅易于獲取，且具有一般成體干細胞的自我更新、無限增殖和多向分化的潛能［8-9］。此外，其還具有較低的免疫源性，在臨床上有著廣泛的應用前景。但有關MenSC用于FSGS治療的研究少有報道。本資料結果顯示，結果顯示MenSC移植組后6+周24h尿蛋白、血肌酐及尿素氮較模型組均顯著降低（P＜0.05或P＜0.01），提示MenSC可在一定程度上緩解FSGS的進程。

多種慢性腎臟病的發生發展均與炎癥存在相關性，FSGS的發生也通常伴隨著炎癥的存在［10-12］。本資料測定了腎組織中炎癥關鍵因子TNF-α和IL-6的表達。TNF-α主要由巨噬細胞分泌，是細胞因子的關鍵成分，可引起免疫細胞的激活，誘導其它細胞因子的產生［13］。有研究表明TNF-α在阿霉素腎病大鼠模型形成中起重要作用［14］。IL-6是一種多功能細胞因子，是調節細胞因子網絡中的關鍵成分。研究顯示IL-6參與多種慢性腎臟病的發生和發展［15］。其既可由淋巴細胞（T細胞和B細胞等）分泌，也可由非淋巴細胞（成纖維細胞和巨噬細胞等）分泌［16］。在本實驗中，RT-PCR結合免疫組化結果顯示FSGS大鼠中TNF-α和IL-6的基因表達和蛋白表達均較正常組明顯增高（P＜0.01），表明FSGS大鼠體內存在炎癥反應。然而，MenSC移植后TNF-α和IL-6的表達均具有一定程度的下調（P＜0.01或P＜0.05），提示MenSC可阻斷炎癥細胞等對TNF-α和IL-6的分泌，進一步減少由TNF-α和IL-6刺激產生的炎癥因子的生成，從而改善FSGS大鼠腎功能。

綜上所述，MenSC移植可緩解FSGS的進程，其作用機制可能是通過抑制腎組織中炎癥細胞因子TNF-α和IL-6的表達。由于FSGS涉及到多種炎癥因子及細胞因子，致病機制復雜，有待于進一步的深入研究。