PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性與乳腺癌的相關性研究

李倩 黃國強*

乳腺癌是女性常見的癌癥之一，在我國女性中乳腺癌的發病率逐年升高，研究顯示每年我國女性新發乳腺癌患者達27萬左右［1］，其中約有3%～8%左右的乳腺癌患者初診時已經轉移［2］，嚴重威脅女性生命健康和生活質量。microRNAs（miRNAs）是一種負調控基因表達的非編碼小RNA，與腫瘤發生、侵襲和轉移密切相關［3］。最近研究表明，miRNA結合位點中的單核苷酸多態影響miRNAs的調控作用，影響相關基因的表達水平，增加疾病的風險［4］。生物信息學分析發現PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性可能與乳腺癌的轉移相關，rs1071738位點位于PALLD基因的3'-UTR處，該位置是miR-96和miR-182的靶點位置。本文探討血漿miR-96和miR-182水平及PALLD基因rs1071738位點SNP與乳腺癌發生風險以及進展的相關性。

1 資料與方法

1.1 一般資料 選擇2014年10月至2017年12月本院收治的乳腺癌患者150例為觀察組，乳腺癌的診斷是2位病理醫師根據世界衛生組織（WHO）《乳腺病理組織學分類》（2012年版）［5］標準讀片確認其病理類型，其中浸潤性導管癌100例，浸潤性小葉癌45例，其它類型癌5例；年齡38～58歲，平均年齡（48.50±8.52）歲。身體質量指數（BMI）為（24.15±3.52）kg/m2；雌激素受體（ER）陽性45例，孕激素受體（PR）陽性39例；TNM分期Ⅰ期52例，Ⅱ期32例，Ⅲ期37例，Ⅳ期29例。同期根據觀察組患者的年齡配對選擇體檢健康的婦女150例為對照組，年齡40～63歲，平 均（48.72±10.15） 歲，BMI（24.22±3.75）kg/m2。排除有其它部位腫瘤的患者、免疫系統疾病的患者。兩組年齡、BMI等一般資料比較差異無統計學意義（P＞0.05），具有可比性。

1.2 PALLD基因分型檢測 取血漿約5ml，EDTA抗凝后血漿用于RNA抽提，血細胞用于基因組DNA提 取。 使 用 QIAamp DNA Blood Mini Kit（QIAGEN，Gaithersburg，MD）試劑盒提取基因組DNA，設計PALLD基因rs1071738位點PCR擴增引物后由金唯智生物科技有限公司合成，其中上游引物序列為5'-AAC CGA GCA GGA CAG AAC-3'；下游引物序列為5'-TGG TGG CAC TCC CAA TAC-3'。以提取的基因組DNA為模板，使用PCR擴增試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）進行PCR擴增，擴增產物由金唯智生物科技有限公司進行測序，根據測序結果分析PALLD基因rs1071738位點基因型。

1.3 miR-96和miR-182測定方法 取分離的血漿，使用Trizol（Invitrogen）抽提總RNA，用miRNease Mini kit（QIAGEN，Gaithersburg，MD）進行分離。為了去除任何對基因組或質粒DNA的污染，使用RQ1 RNase-free DNase（Promega，Madison，WI）進行處理。用實時定量RT-PCR檢測處理后的RNA樣品中miR-96和miR-182的表達量，使用的試劑盒是 TaqMan miRNA assay（Applied Biosystems，Foster City，CA），內參為RNU6B，所有操作均嚴格按照試劑盒說明書進行。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0統計學軟件。計量資料以（s），采用單因素方差分析或t檢驗；計數資料以［n（%）］表示，用χ2檢驗。使用χ2檢驗分析基因型頻率是否符合Hardy-Weinberg平衡。使用非條件Logistic回歸分析計算比值比（OR）和95%置信區間（CI），分析不同基因型與乳腺癌發生風險之間的相關性。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 PALLD基因rs1071738位點基因型和等位基因頻率 PALLD基因rs1071738位點基因型頻率符合Hardy-Weinberg平衡（P＞0.05）。觀察組患者與對照組PALLD基因rs1071738位點基因型頻率之間的差異有統計學意義（χ2=31.589，P＜0.001），以野生型（GG）作為參考，雜合子（GC）和純合子（CC）均是乳腺癌的保護因素（OR=0.140，95%CI：0.058～0.329，P＜0.001；OR=0.240，95%CI：0.050～0.098，P=0.024）。觀察組患者C等位基因頻率顯著低于對照組，差異有統計學意義（χ2=31.582，P＜0.001），以G等位基因為參考，C等位基因是乳腺癌的保護因素（OR=0.200，95%CI：0.104～0.379，P＜0.001），見表 1。

表1 PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性與乳腺癌風險［n（%）］

2.2 PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性與乳腺癌分期的相關性 合并TNM分期Ⅰ期和Ⅱ期以及Ⅲ與Ⅳ期，分析PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性與不同TNM分期的相關性，結果顯示不同基因型患者TNM分期的差異有統計學意義（χ2=5.871，P=0.015），以野生型為參考，突變型乳腺癌患者進 展 期 的 較 少（OR=0.114，95%CI：0.005～0.904，P=0.015），見表 2。

表2 PALLD基因rs1071738位點基因多態性與乳腺癌患者TNM分期相關性

2.3 血漿miR-96和miR-182水平 采用RT-PCR檢測所有受試者血漿miR-96和miR-182水平，結果顯示乳腺癌患者血漿中miR-96和miR-182水平顯著低于對照組，差異均有統計學意義（P＜0.001），見圖1。

圖1 血漿miR-96和miR-182水平比較

2.4 血漿miR-96和miR-182水平與乳腺癌分期的相關性 分析乳腺癌患者不同TNM分期與血漿miR-96和miR-182水平之間的相關性，結果顯示Ⅰ、Ⅱ期患者血漿miR-96和miR-182水平顯著高于Ⅲ、Ⅳ期患者，差異均有統計學意義（P＜0.001），見圖2。

圖2 不同TNM分期的乳腺癌患者血漿miR-96和miR-182水平

2.5 PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性與血漿miR-96和miR-182水平的關系 分析PALLD基因rs1071738位點不同基因型受試者血漿miR-96和miR-182水平，結果顯示，野生型受試者血漿miR-96和miR-182水平顯著低于突變型受試者，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3A。分析乳腺癌患者血漿miR-96和miR-182水平與PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性之間的相關性，結果顯示野生型乳腺癌患者血漿miR-96和miR-182水平顯著低于突變型乳腺癌患者，差異均有統計學意義（P＜0.05），見圖3B。

圖3 PALLD基因rs1071738位點基因多態性與血漿miR-96和miR-182水平相關性。A圖為所有受試者血漿miR-96和miR-182水平，B為乳腺癌患者中血漿miR-96和miR-182水平。

3 討論

乳腺癌早期診斷和檢測是其篩查的主要方式。目前的常規篩選試驗由于假陽性結果而具有危險性或不可靠性，因此需要鑒定用于乳腺癌的可靠和早期檢測的新型非侵入性或微創生物標志物。基于體液的microRNA為早期檢測乳腺癌提供極好的非侵入性診斷工具［6-9］。近年來，microRNA的表達改變被認為是包括乳腺癌在內的各種癌癥中最可靠的診斷生物標志物［10］。

PALLD基因起始位點和選擇性剪接導致該基因編碼多個亞基，其亞基參與細胞的遷移，尤其是乳腺癌細胞的遷移［11］。通過細胞外基質降解與細胞骨架［11］的連接、調節胞漿體和胞壁凸出形成［12-13］等多種機制，促進細胞的侵襲和運動。PALLD基因表達的Palladin蛋白與miR-96和miR-182表達呈顯著的負相關關系，Palladin表達與浸潤性乳腺癌細胞淋巴結轉移呈正相關［14］。本資料結果顯示，在乳腺癌患者血漿中的miR-96和miR-182水平顯著低于健康對照組，筆者認為乳腺癌患者血漿中miR-96和miR-182水平低，Palladin蛋白水平較高，而高水平的Palladin蛋白參與對于細胞的遷移和侵襲活動具有促進作用。本資料中Ⅲ期和Ⅳ期乳腺癌患者血漿中miR-96和miR-182水平低，同理Palladin蛋白水平較高，細胞的遷移和侵襲活動較強。

本資料結果顯示，攜帶突變型C等位基因的群體患乳腺癌的風險低于野生型等位基因（G）攜帶者，且突變型乳腺癌患者進展的風險較低。野生型患者血漿miR-96和miR-182水平顯著低于突變型，作者推測C等位基因與miR-96和miR-182能夠更好的結合，使miR-96和miR-182能夠更好的發揮調控作用，顯著降低Palladin蛋白的表達，降低乳腺癌的發生率和乳腺癌細胞的遷移和侵襲能力。然而，有研究者認為miR-96在乳腺癌中具有促癌作用，如有研究者發現miR-96可能通過調節ABCA1抑制細胞凋亡，從而在乳腺癌中發揮致癌作用［15］。Hong等［16］研究認為miR-96可通過沉默PTPN9促進乳腺腫瘤發生，對于不同研究結果作者認為miR-96在機體內的靶點并不唯一，通過不同靶點作用可能產生不同的調控結果。

綜上所述，PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性與乳腺癌的發生風險和進展相關，可能機制是PALLD基因rs1071738位點單核苷酸多態性影響miR-96和miR-182的調控作用。