丙泊酚對小鼠外側下丘腦促覺醒腦區的作用及覺醒和意識水平的影響*

王文聰，張超，劉利元,3，陳楊，張銘，易斌，魯開智，楊明友**

(1.陸軍軍醫大學第一附屬醫院 手術麻醉科， 重慶 400038； 2.重慶三博江陵醫院 麻醉科， 重慶 400021； 3.中國人民解放軍77611部隊， 西藏 拉薩 850000)

臨床上，丙泊酚是常用全身麻醉的誘導和維持藥物[1]。臨床實踐和動物實驗表明，丙泊酚麻醉具有起效快、無殘留及醒后無宿醉感的優點[2-4]。丙泊酚產生麻醉效應的神經機理尚不完全清楚，研究認為丙泊酚可調控學習記憶相關的海馬活動，抑制海馬錐體神經元放電，抑制突觸傳遞和可塑性，并減少各種興奮性遞質的釋放，進而引起麻醉中認知功能下調[5-6]，丙泊酚也可直接抑制額葉皮層和內嗅皮層等腦區活動[7]。已有研究揭示，外側下丘腦與覺醒、意識高度相關[8]。腦炎病毒感染損害外側下丘腦后，可引起嚴重嗜睡、覺醒及警覺水平下降。近來，采用毀損實驗、光遺傳和神經藥理實驗，發現毀損或抑制外側下丘腦可抑制覺醒產生，相反激活外側下丘腦則可誘發睡眠向覺醒的轉換[8]。本研究將探討丙泊酚是否對作用下丘腦對覺醒與警覺功能產生影響。

1 材料與方法

1.1 動物、主要試劑及儀器

20只C57小鼠，動物由陸軍軍醫大學動物中心提供，體質量25 g，雄性；試劑丙泊酚，多聚甲醛及DAPI購置于Tocris公司；微量注射泵(IVM-1000,英國Scientifica)，德國Leica冰凍切片機，生理采集處理系統(AWG5200，泰盟)，腦立體定位儀(中國瑞沃德)，腦電與肌電記錄電極(中國瑞沃德)。

1.2 方法

1.2.1給藥導管和腦電(EEG)與肌電(EMG)電極埋置 將小鼠用1%戊巴比妥鈉麻醉，固定于腦立體定位儀上，用碘伏、酒精依次消毒，除去顱骨表面軟組織，暴露顱骨及前囟和后囟點。記錄EEG的不銹鋼螺絲(直徑1 mm)電極埋置于分別埋置于額葉(以前囟為標志，向前1 mm，中線旁開1.5 mm，深0.8 mm)與頂葉(以前囟為標志，向后2 mm，中線旁開1.5 mm，深0.8 mm)。兩根采集EMG的電極埋置于左右頸部肌肉。通過記錄動物的EEG與EMG檢測睡眠覺醒狀態。以前囟為標志，外側下丘腦給藥導管定位坐標前囟后1.65 mm，中線旁開1.2 mm，深4.8 mm，用牙科鉆在顱骨表面鉆孔。用牙科水泥將EEG與EMG記錄電極和導管固定于顱骨表面。完成手術后，將小鼠放置于養籠中恢復。

1.2.2分組及微量給藥 20只小鼠隨機均分為對照組和丙泊酚組，對照組在小鼠外側下丘腦微量注射0.9% NaCl 0.3 μL，參照文獻[7-9]丙泊酚組在小鼠外側下丘腦微量注射丙泊酚0.3 μL，微量給藥速度為0.15 μL/min，給藥后留針1 min。

1.2.3EEG與EMG數據采集和分析 小鼠手術后第7天開始采集數據，記錄時室溫保持22～23 ℃,6∶00-18∶00為光照時間，18∶00-次日6∶00為黑暗時間，小鼠自由由獲得食物和水。待小鼠適應記錄場景后，記錄1 d的數據，評價EEG與EMG的質量以及小鼠睡眠/覺醒節律是否正常。待小鼠適應記錄系統后，開始外側下丘腦給藥。為排除睡眠節律的影響，給藥時間為18∶00，記錄藥后3 h(18∶00-21∶00)的數據用Neuroexplorer(5.0)軟件分析，解析出EEG與EMG的對應關系，并經過人工核對，校正結果中不合理的判定。

1.2.4導管埋置位點檢測 小鼠完成記錄后，采用0.9% NaCl(37 ℃)和4%多聚甲醛(4 ℃)進行心臟灌注、立即取腦置4%多聚甲醛中定，隨即轉移至30%蔗糖和4%多聚甲醛溶液中脫水；待腦組織沉底后，冰凍切片，厚度為50 μm；按冠狀面對外側下丘腦連續切片，DAPI染色、封片，在熒光顯微鏡下觀察導管埋置位點，導管埋置不準的動物不納入統計。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 EEG與EMG監測判斷小鼠腦功能狀態

如圖1所示，通過分析各組小鼠EEG與EMG，小鼠大腦EEG分為覺醒期、非快眼動睡眠(NREM)和快眼動睡眠(REM)，覺醒期EEG主要表現為高頻、低幅度，此時較大幅度的EMG；NREM睡眠期EMG幅度較小，EEG；表現為低頻、高幅度；REM睡眠期；EMG幅度較小，EEG出現特征性規律的θ振蕩。見圖1。

圖1 EEG與EMG監測動物NREM睡眠、REM睡眠及覺醒狀態結果Fig.1 Monitoring of NREM sleep, REM sleep and arousal status by EEG and EMG

2.2 丙泊酚對小鼠大腦覺醒時間、NREM和REM睡眠時間的影響

結果顯示，外側下丘腦微量注射丙泊酚后，與對照組比較，小鼠覺醒時間顯著減少、NREM和REM睡眠時間顯著增加，差異有統計學意義(P<0.001)，見圖2；表明丙泊酚作用于小鼠外側下丘腦可引起睡眠樣行為，提示外側下丘腦可能是丙泊酚發揮麻醉效應重要的靶區。

注：(1)與對照組比較，P<0.001。圖2 丙泊酚作用外側下丘腦對小鼠覺醒時間、NREM和REM睡眠時間的影響Fig.2 Effects of propofol on arousal time, NREM and REM sleep time in lateral hypothalamus of mice

注：(1)與對照組比較，P<0.001。圖3 外側下丘腦微注射丙泊酚后誘導出睡眠樣EEG 能量譜Fig.3 Sleep-like EEG energy spectrum induced by microinjection of propofol into lateral inferior colliculus

2.3 外側下丘腦微注射丙泊酚后誘導出睡眠樣EEG 能量譜

EEG的能量譜可反映大腦功能狀態。覺醒和警覺性高的時期，神經元興奮性高、神經元集群電活動去同步化，表現出高頻θ(4～10 Hz)振蕩強，低頻δ(0.5～4 Hz)振蕩弱；相反，NREM睡眠期神經元興奮性下降，出現高幅度同步化的δ振蕩。如圖3所示，外側下丘腦微注射丙泊酚后可引起低頻的δ振蕩(0.5～2 Hz)顯著增加(P<0.001)，與警覺密切相關的θ(4～10 Hz)振蕩能量下降(P<0.001)，但不影響更高頻的α(10～20 Hz)振蕩能量。結果表明，外側下丘腦微注射丙泊酚可降低皮層興奮性、引起皮層神經元集群同步化活動、降低小鼠覺醒和警覺水平。

3 討論

靜脈注射丙泊酚導致覺醒和警覺水平下降，引起麻醉效應。目前，丙泊酚麻醉的神經機制尚不完全清楚。本研究發現在外側下丘腦局部微注射丙泊酚，可引起睡眠樣行為改變。通過EEG能量譜分析，發現丙泊酚引起EEG低頻δ振蕩能量增加，而減少腦電高頻的θ振蕩。上述結果表明，丙泊酚可直接作用于外側下丘腦，降低皮層興奮性、引起皮層神經元集群同步化活動、進而降低小鼠覺醒和警覺水平。該結果為丙泊酚產生麻醉效應提供了新的神經機理。

外側下丘腦接受前額葉錐體神經元、背縫核五羥色胺能神經元、中腦多巴胺能神經元和基底前腦乙酰膽堿能神經元輸入，廣泛投射至前額葉、丘腦以及基底前腦[8,10]。大量文獻報道，外側下丘腦與覺醒與警覺程度高度相關。毀損或抑制外側下丘腦可引起昏睡樣行為表現，相反光/藥物遺傳激活外側促覺醒神經元可快速誘導動物從睡眠向覺醒轉換[8]。本研究發現外側下丘腦微注射丙泊酚可使覺醒時間減少，EEG能譜出現睡眠樣變化，該結果表明外側下丘腦可能丙泊酚發揮麻醉作用重要的靶區。

在新皮層及皮層下海馬區域，一方面丙泊酚直接作用于興奮性神經元的胞體，增強鉀通道或抑制超極化激活非選擇性陽離子通道，使神經元發生超極化，引起興奮性下調。另一方面，丙泊酚亦可增強抑制性輸入，進而抑制這些腦區的興奮性[7,9,11-13]。因此，推測丙泊酚也可通過上述的方式引起外側下丘腦神經元興奮性下降，進而促進睡眠樣行為的發生，覺醒和警覺水平下降。

外側下丘腦具有多種不同神經元類型，主要包括食欲素(Orexin)神經元、γ-氨基丁酸(GABA)神經元、谷氨酸能神經元以及黑色素聚集激素(MCH)神經元。近來，神經元特異性操控技術發現這些神經元具有不同功能，orexin神經元與GABA能神經元具有強烈的促覺醒作用，而MCH神經元則主要參與REM睡眠的發生[14]。本研究側重于睡眠/覺醒行為學的觀察，丙泊酚是否特異性抑制外側下丘腦促覺醒神經元(orexin與GABA能神經元)及其分子機制尚不清楚，將來還需進一步研究。

綜上，丙泊酚作為臨床上常用的麻醉藥物，具有起效迅速、殘留少，但其關鍵性的作用機制并不清楚，并阻礙了選擇性達到麻醉理想效應而較少產生呼吸與神經心理不良反應的新麻醉藥的開發。本研究發現外側下丘腦是丙泊酚發揮麻醉效應重要的靶區，該發現有望為理想麻醉藥物的開發提供重要的理論依據。