雙吲哚馬來酰亞胺衍生物GZWM-051誘導白血病細胞凋亡的作用及機制*

劉務玲， 姚堯， 陳娟， 吳昌學， 宋晶睿， 王春林， 邱劍飛，王立平， 朱偉明,3， 龍群**， 李艷梅**

(1.貴州省中國科學院 天然產物化學重點實驗室， 貴州 貴陽 550014; 2.貴州醫科大學， 貴州 貴陽 550025; 3.中國海洋大學， 山東 青島 266100)

白血病，又稱血癌，是未成熟的血細胞異常過度增殖而導致的一種血液癌癥，主要有急性淋巴細胞白血病、急性髓系白血病(acute myeloid leukemia, AML)、慢性淋巴細胞白血病及慢性髓系白血病[1-2]。AML是白血病的一種，其特征是異常細胞在骨髓和血液中快速增殖，干擾正常血細胞功能。AML進展較為迅速，如果沒有獲得有效治療，患者通常會在數周至數月內死亡。據統計,2015年全球約有白血病患者230萬人，其中約100萬人患有AML，美國癌癥協會根據統計數據預測2018年在美國AML將是死亡案例最多的白血病。目前，臨床上主要采用化療方案治療AML[4]，米哚妥林(midostaurin，PKC-412)是目前美國FDA唯一批準用于靶向麥克唐納貓肉瘤(feline mcdonough sarcoma, FMS)樣的酪氨酸激酶3 (Fms-like tyrosine kinase, FLT3)治療AML的藥物[5]，該藥物在臨床使用后會部分出現耐藥，導致治療效果不佳[6]。因此，開發更多治療AML的新藥尤為重要。HEL細胞是AML中紅白血病的一種細胞系，可作為AML相關研究的典型細胞[7-10]，本研究選擇HEL細胞作為研究對象，研究雙吲哚馬來酰亞胺衍生物化合物GZWM-051對HEL細胞的作用，并探討其作用機制。

1 材料與方法

1.1 主要材料

人HEL細胞、人慢性髓系白血病K562細胞為實驗室留存，雙吲哚馬來酰亞胺衍生物GZWM-051由中國海洋大學朱偉明教授課題組設計合成，純度>95%。RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國Hyclone公司，細胞凋亡檢測試劑盒購自美國BD公司；Hoechst 33258、MTT試劑及二甲基亞砜(DMSO)購自北京索萊寶科技有限公司，蛋白裂解液及BCA蛋白測定試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司，PVDF膜購自美國Bio-Rad公司；Bcl-2、Casepase-3、Caspase-3剪切體(cleaved casepase-3)、GAPDH(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase)一抗購自美國Abcam公司，熒光標記抗兔二抗購自美國CST公司。

1.2 方法

1.2.1細胞增殖活性采用MTT法，取對數期增長的HEL、K562細胞以8×103個/孔接種于一次性滅菌96孔板，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養過夜，分別使用0.05、0.10及0.20 μmol/L GZWM-051，每個濃度設5個復孔，同時設陰性對照(等量DMSO)和陽性對照(0.2 μmol/L PKC-412)。在37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24、48及72 h，分別加入5 000 mg/L的MTT試劑，然后37 ℃、5% CO2細胞培養箱培養4 h，2 000 r/min離心20 min收集細胞，加入DMSO后置于搖床180 r/min動態處理20 min，490 nm波長下測定吸光度值(OD490值)；計算GZWM-051對細胞系的IC50及抑制率，繪制生長曲線。

1.2.2HEL細胞凋亡采用流式細胞術，取對數生長期HEL細胞以2×106個/孔接種于6孔板，使用0.025、0.050及0.100 μmol/L GZWM-051分別處理細胞，實驗設陰性對照組(等量DMSO)；置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24及48 h，收集細胞，用1×PBS洗滌細胞， 2 000 r/min 離心5 min收集細胞；將細胞凋亡試劑用10×binding buffer稀釋10倍，于細胞沉淀中加入稀釋后的細胞凋亡試劑100 μL，徹底重懸細胞后轉移至1.5 mL離心管；加入PI染液及Annexin V-FITC染液各5 μL，輕輕混勻，避光37 ℃處理15 min，立即上流式細胞儀檢測。

1.2.3HEL細胞凋亡采用Hoechst 33258染色，取對數生長期HEL細胞以1×105個/孔接種于6孔板，以0.025、0.050 及0.100 μmol/L GZWM-051分別處理細胞，實驗設陰性對照組(等量DMSO)。細胞置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養24 h，用1×PBS洗滌細胞，離心收集細胞，用甲醇固定細胞10 min，再用1×PBS洗滌細胞，用Hoechst 33258處理細胞，室溫避光染色10 min。去除染色液后用1×PBS洗滌2次，置于熒光顯微鏡上檢測并分析。

1.2.4腫瘤細胞凋亡相關蛋白采用Western blot法，取對數生長期HEL細胞以4×105/孔接種于100 mm細胞培養皿中，細胞置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養過夜，使用0.025、0.050及0.100 μmol/L GZWM-051分別處理細胞，置于37 ℃、5% CO2細胞培養箱中培養，實驗設陰性對照組(等量DMSO)。培養24 h時，收集細胞，用預冷1×PBS洗滌細胞，離心收集細胞，加入含PMSF的蛋白裂解液，轉移至1.5 mL離心管中。每隔5 min渦旋1次，冰上裂解30 min后置預冷離心機中12 000 r/min離心15 min。取上清液轉移至新離心管中。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白樣品濃度，用蛋白裂解液調平濃度，加入上樣緩沖液，100 ℃加熱煮沸5 min變性蛋白，置-80 ℃保存備用。用SDS-PAGE凝膠分離蛋白樣品后轉移至0.2 μm的PVDF膜，用5%脫脂牛奶封閉后用抗體4 ℃孵育過夜，1×TBS洗膜，用熒光標記抗兔二抗室溫孵育2 h，1×TBS洗膜，用雙色紅外熒光成像系統檢測和分析。

1.3 統計學方法

2 結果

2.1 細胞增殖活性

MTT結果顯示， GZWM-051能顯著抑制HEL及K562細胞的增殖活性，GZWM-051處理HEL、K562細胞72 h時的IC50值分比為(0.06±0.01)及(1.45±0.28)μmol/L，均<2 μmol/L； GZWM-051以劑量依賴的方式顯著抑制HEL細胞的增殖活性，且GZWM-051處理濃度為0.20 μmol/L時、對HEL細胞增殖活性的抑制能力強于陽性對照試劑PKC-412(圖1)。

圖1 不同濃度GZWM-051處理HEL細胞的生存曲線Fig.1 HEL cell proliferation in the presence of different concentrations of GZWM-051

2.2 細胞凋亡

流式細胞術檢測結果顯示，處理24及48 h時，各GZWM-051濃度組的HEL細胞凋亡率顯著高于陰性對照組，差異有統計學意義(P<0.01)；48 h時的各GZWM-051濃度組HEL細胞凋亡率顯著高于24 h各GZWM-051濃度組(圖2)。Hoechst33258染色后，凋亡細胞的染色質皺縮而發生的高亮，且GZWM-051化合物對HEL細胞處理的濃度越高，細胞凋亡現象越明顯(圖3)。

2.3 細胞凋亡相關蛋白表達水平

Western blot結果顯示，0.05、0.10 μmol/L GZWM-051組HEL細胞抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平較陰性對照組顯著降低，差異有統計學意義(P<0.01)；各GZWM-051濃度組及陰性對照組細胞凋亡效應蛋白Casepase-3表達水平比較，差異無統計學意義(P>0.05)；各GZWM-051濃度組Cleaved Casepase-3表達水平較陰性對照組顯著升高，差異有統計學意義(P<0.01)。見圖4。

3 討論

2017年，米哚妥林(Midostaurin，PKC-412)被美國FDA批準用于臨床靶向FLT3治療AML[5]。而本研究結果顯示化合物GZWM-051對HEL細胞的抗增殖活性強于PKC-412，并且GZWM-051對HEL細胞的IC50值僅為(0.06±0.01)μmol/L，提示微量的化合物GZWM-051即可顯著抑制白血病細胞HEL的增殖。MTT法檢測結果顯示，化合物GZWM-051以劑量依賴方式明顯抑制HEL細胞的增殖活性。不僅如此，化合物GZWM-051也對慢性髓系白血病細胞K562有著較好的抑制增殖活性，IC50值僅為(1.45±0.28)μmol/L，提示化合物GZWM-051具有重要的潛在臨床應用前景。

1972年，科學家用電子顯微鏡研究組織時觀測到與創傷性細胞死亡不同的細胞凋亡現象[11]。細胞凋亡，也稱為程序性細胞死亡，是發生在多細胞動物中高度調控和受控的過程，其特征是細胞形態改變、死亡。形態學變化包括氣泡、細胞收縮、核碎裂、染色質凝結、染色體DNA碎裂和整體mRNA衰減。細胞凋亡可通過兩種途徑啟動——線粒體途徑(內源性途徑)和死亡受體途徑(外源性途徑)，這兩種途徑都是通過激活Caspase導致細胞死亡[12-14]。Caspase是一類在細胞程序性死亡和炎癥中起重要作用的蛋白酶，所有已知的Caspase都具有一個半胱氨酸活性位點，并在Asp-XXX鍵上(即天冬氨酸殘基之后)裂解底物[15]。研究已發現Caspase酶有1 500多種底物，并且數量將會越來越多[16]。Caspase的激活確保細胞成分以可控的方式降解，在對周圍組織影響最小的情況下導致細胞死亡[17]。Caspase-3是細胞凋亡過程中的一種終末剪切酶(凋亡效應蛋白)，在細胞凋亡過程中起關鍵作用[18-19]。需要注意的是，凋亡信號通路激活后，Caspase-3需要被裂解成為Cleaved Caspase-3才能發揮其剪切活性[20]。在本研究中，化合物GZWM-051促使HEL細胞Caspase-3蛋白表達水平下調，其剪切體Cleaved Caspase-3表達水平上調，說明化合物GZWM-051通過激活Caspase-3，引起細胞凋亡。Bcl-2家族由一組同源蛋白組成，同源區域目前發現有4個(BH1、BH2、BH3及BH4); Bcl-2家族可分為促凋亡蛋白和抗凋亡蛋白，在調節細胞凋亡、腫瘤發生和細胞對抗癌治療的反應等方面具有重要的作用[21]。Bcl-2是Bcl-2家族的抗凋亡蛋白，作用于線粒體膜通透性，抑制細胞色素C的釋放[12,22-23]。細胞色素C在凋亡過程中起中間作用，參與激活半胱氨酸蛋白酶Caspase-9，而Caspase-9可以繼續激活Caspase-3和Caspase-7，從而引起細胞凋亡[12,24]。本研究顯示，0.025 μmol/L化合物GZWM-051處理24 h即可誘導HEL細胞凋亡，從而抑制細胞的增殖。化合物GZWM-051誘導HEL細胞抗凋亡蛋白Bcl-2下調，提示化合物GZWM-051通過內源性途徑，提高線粒體膜通透性，增加細胞色素C的釋放，激活凋亡下游通路，觸發級聯反應并促進細胞發生凋亡。

注：A、B為GZWM-051處理24 及48 h，C為柱狀圖；(1)與DMSO組比較，P<0.01。圖2 不同濃度GZWM-051處理HEL細胞24及48 h時的細胞凋亡檢測(流式細胞術)Fig.2 Compound GZWM-051 promoted HEL cell line apoptosis

圖3 不同濃度GZWM-051處理HEL細胞后細胞凋亡現象(Hoechst33258染色，×200)Fig.3 Apoptosis of HEL cell line induced by compound GZWM-051

注：(1)與陰性對照組比較，P<0.01。圖4 不同濃度GZWM-051處理HEL細胞后細胞凋亡相關蛋白表達水平Fig.4 Compound GZWM-051 affected relevant protein expression level of HEL cell

綜上所述，雙吲哚馬來酰亞胺衍生物GZWM-051具有良好的抗白血病活性，是白血病患者的潛在治療藥物，其通過下調抗凋亡蛋白Bcl-2表達水平和激活Caspase-3剪切體水平誘導HEL細胞凋亡。