蛹蟲草菌絲體液體發酵條件的優化研究

劉 然 曲亮璠 王祥河 許勤虎 史連生

1（天津量信檢驗認證技術有限公司，天津 300462）2（天津市工業微生物研究所有限公司，天津 300462）3（天津實發中科百奧工業生物技術有限公司，天津 300462）

蛹蟲草（Cordyceps militaris）營養價值豐富，高蛋白，低脂肪，維生素和礦物質含量較高，是藥食同源性真菌，在我國分布廣泛。蛹蟲草與冬蟲夏草的功效成分和藥理作用類似，其中多糖類、蟲草酸、蟲草素、超氧化物歧化酶（SOD）等功能性物質具有抗菌、抗炎、抗腫瘤、抗氧化、調節免疫系統等功能，近年來逐漸成為國內外的研究熱點。蛹蟲草菌絲體液體發酵方法與傳統的人工培養方法不同，具有速度快、周期短、產量高、條件易于控制等特點，是一種新的產業化途徑，具有良好的商業價值和廣闊的市場空間。液體培養基的組分和配比以及發酵過程中pH 值、接種量、轉速、溫度等各個條件的控制對微生物菌絲體的繁殖和代謝產物的累積有直接的聯系。因此，若要提高蛹蟲草菌絲體的產量，首先要篩選出適宜發酵的培養基組成，再對發酵的工藝條件進行優化。本文通過單因素、響應面試驗，優化了蛹蟲草液體發酵生產菌絲體的工藝，旨在為其工業化生產奠定理論基礎，也為開發新的保健食品、尋找新的藥食來源提供科學依據和新的思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株蛹蟲草（Cordyceps militaris），菌種編號：CICC 14013。

蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B12均為分析純。

1.2 儀器與設備

METTLER AE200 分析天平；METTLER Seven Multi pH 計；蘇州凈化SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺；日本三洋MLS-3750 高壓滅菌鍋；上海安亭GL-20G-II 高速冷凍離心機；博迅GZX-9146 MBE 數顯鼓風干燥箱。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草液體發酵試驗

1.3.1.1 液體種子的制備

斜面培養基：馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂20 g/L。

液體種子培養基：蔗糖40 g/L，蛋白胨20 g/L，磷酸二氫鉀1 g/L，硫酸鎂1 g/L。

采用500 mL 三角瓶用于液體種子培養，接入1 cm2的斜面菌種，搖床轉速180 r/min，裝液量為200 mL，溫度22 ℃，培養5 d。

1.3.1.2 發酵單因素試驗

發酵培養基：蔗糖40 g/L、蛋白胨30 g/L、硫酸鎂1.5 g/L、磷酸二氫鉀1.5 g/L、維生素B1適量、維生素B12適量。選擇常見的蛋白胨和酵母膏作為氮源，葡萄糖、蔗糖和麥芽糖作為碳源，篩選出最佳液體培養基成分；分別選取不同pH 值（5、6、7、8、9），不同發酵溫度（19 ℃、22 ℃、25 ℃、28 ℃、31 ℃），不同搖床轉速（130 r/min、150 r/min、170 r/min、190 r/min、210 r/min），不同接種量（2.5%、5.0%、7.5%、10.0%），不同裝液量（60 mL、80 mL、100 mL、120 mL、140 mL），以蛹蟲草發酵產物中的菌絲體生物量為指標，發酵過程中保證其他條件不變，搖床振蕩培養6 d，進行單因素試驗。

1.3.1.3 發酵響應面試驗

在上述單因素試驗結果的基礎上，進行三因素三水平響應面優化試驗，以獲得最佳發酵條件和最大菌絲體產量。

1.3.2 菌絲體產量測定方法

發酵產物中菌絲體的產量采用細胞干重法測定，取發酵產物于6 000 r/min 冷凍離心20 min，棄去上清液，用蒸餾水將菌絲體洗凈后，重復上述試驗操作，將得到的菌絲體置于60 ℃干燥箱中烘干至恒重。菌絲體產量按下式計算：

式中：X——菌絲體生物量，g/L；

W——菌絲體干重，g；

V——取樣體積，mL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 蛹蟲草發酵最適碳、氮源種類篩選

在液體培養發酵中，碳源是除水分外細胞生長需要量最多的營養物質，為蛹蟲草生長、合成物質提供能量，約占細胞干重的50%。氮源的基本作用是為微生物生長過程中蛋白質以及核酸的合成提供原料。由于微生物種類不同，生理特性有所差異，所能利用的碳源、氮源品種亦不相同。采用常見的單糖、雙糖、低聚糖分別與蛋白胨和酵母膏組合，以菌絲體產量為判斷標準，篩選出蛹蟲草發酵的最適碳氮源。不同碳源、氮源組合對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響見表1。由表1 可知，碳源對蛹蟲草菌絲體產量的影響高于氮源。當蔗糖被用作發酵碳源時，菌體的生長速度更快，產量更高，所得菌絲體生物量高于利用葡萄糖和麥芽糖發酵所得。這可能是因為蔗糖更適合蛹蟲草生長，更容易被菌體細胞吸收和轉化。此時以蔗糖- 蛋白胨為培養基的蛹蟲草發酵6 d，生物量達到最大值，為25.2 g/L。

表1 不同碳源、氮源組合對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響

2.1.2 溫度對菌絲體產量的影響

蛹蟲草菌絲體的合成和各種功效成分的累積是在菌體內各種酶的催化條件下進行的，而酶的活性與溫度密切相關。為了達到菌絲體生長速率快、代謝速度高的目的，在發酵過程中對于溫度的控制尤為重要。不同溫度對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響如圖1 所示。

圖1 不同溫度對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響

由圖1 可知，蛹蟲草菌絲體在19 ℃～31 ℃范圍內均可生長。當溫度處于19 ℃～25 ℃，菌絲體產量較為理想；溫度高于28 ℃，菌體產量顯著下降。當溫度為22 ℃時，菌絲體產量達到最高，為25.0 g/L。溫度過低、過高都會使菌體內酶的活力降低、蛋白質合成速度減慢，因此將蛹蟲草的液體發酵溫度定為22 ℃。

2.1.3 裝液量對菌絲體產量的影響

裝液量的多少可以反應出搖瓶中的通氣量，從而影響菌體生長所需氧氣的供給和發酵過程中廢氣的排放，發酵搖瓶內培養基裝液量過高或過低，都不利于蛹蟲草菌絲體的富集培養，影響發酵結果。不同裝液量對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響如圖2所示。

由圖2 可知，當發酵搖瓶的裝液量為100 mL時，蛹蟲草的生長情況最好，獲得的菌絲體最多，此時菌絲體產量達到25.4 g/L。

2.1.4 pH 對菌絲體產量的影響

過高、過低的pH 值都會影響真菌體內多糖和蛋白質合成過程中相關酶的活性，不利于其菌體生長。不同pH 值對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響如圖3 所示。

由圖3 可知，隨pH 值在5～9 范圍內變化，菌絲體的產量呈現先增大后減小的趨勢，當pH 值為7 時，其產量達到最大值24.6 g/L。

圖2 不同裝液量對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響

圖3 不同pH 值對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響

2.1.5 接種量對菌絲體產量的影響

通過接種，可以在蛹蟲草發酵過程中為其提供生命力強、生長旺盛的種子。不同接種量對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響如圖4 所示。

圖4 不同接種量對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響

由圖4 可知，隨著接種量的增加，菌絲體產量呈先上升后下降的趨勢。其原因可能是菌株在有限的營養條件下，適宜的接種量可使菌絲體生長旺盛，各營養物質的代謝與轉化主要流向菌絲體生長。隨后，培養基的營養成分幾乎被利用完全，菌絲體達到最大生長限度，開始產生或外溢一些代謝副產物和中間體，其蛋白水解酶的活力逐漸升高，并伴隨著菌絲體自溶現象的產生，菌體產量降低。當接種量達到10.0%時，菌絲體產量略有下降。因此，蛹蟲草發酵的最佳接種量為7.5%，此時生物量為25.1 g/L。

2.1.6 搖床轉速對菌絲體產量的影響

使用搖瓶進行發酵培養時，搖床轉速的大小間接影響著發酵液中氧氣溶解量的多少。蛹蟲草是好氧型微生物，振蕩培養可以解決其發酵過程中的缺氧問題，氧氣的供應影響著菌體生長的快慢及質量。若轉速過快，則通氧量過大，在搖瓶相同的裝液量條件下，對蛹蟲草菌絲體的剪切力也相對較大，不利于菌體的快速增殖和延伸；若轉速過慢，則通氧量不足，剪切力過小，造成菌絲生長遲緩，菌絲體產量低。不同搖床轉速對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響如圖5 所示。

圖5 不同搖床轉速對蛹蟲草發酵菌絲體產量的影響

由圖5 可知，當轉速為170 r/min 時，蛹蟲草菌絲體生長速度最快，生物量達到24.9 g/L。

2.2 響應面試驗結果

根據單因素試驗結果，選取pH 值、接種量、搖床轉速3 個因素，以發酵產物中菌絲體產量為指標，利用中心組合（Box-Benhnken）試驗設計原理，進行三因素三水平的響應面試驗，其因素與水平見表2，試驗結果見表3，方差分析見表4。

表2 響應面試驗因素與水平

表3 響應面試驗結果

表4 方差分析結果

由表4 可知，此模型P＜0.000 1，具有高度的顯著性，其決定系數R2為0.986 4，表明所建立的模型擬合性良好。失擬項P=0.697 9＞0.05，沒有顯著性，說明試驗的誤差較小。在選擇試驗范圍內，由F 值大小確定3 個因素對蛹蟲草菌絲產量影響程度排序：pH（A）＞轉速（C）＞接種量（B）。在二次項中，AC、BC 對蛹蟲草菌絲產量有顯著的影響，說明AC、BC 之間存在交互作用；AB 對蛹蟲草的菌絲產量沒有顯著影響，表明2種因素之間沒有相互作用。響應值的變異系數CV值為0.96%，表明試驗操作可信。根據所得數據進行回歸分析，擬合得到蛹蟲草發酵菌絲產量的預測值對各因素的回歸方程為：Y=28.78-1.39A- 0.31B+ 0.48C + 0.05AB - 0.48AC - 0.33BC - 1.31A2-0.66B2- 1.09C2。

經Design-Expert 分析，給出的最優工藝參數如表5 所示。為了驗證模型的適用性，結合實際操作的便捷性，將上述條件調整為pH 值6.40，接種量6.50%，搖床轉速180.00 r/min，得到菌絲體產量為29.30 g/L，與預測可獲得的菌絲體產量29.4 g/L 較為接近，說回歸明模型與真實試驗值擬合度較高，能夠有效的提高蛹蟲草菌絲體產量。

表5 Design-Expert 預測最優工藝及驗證

3 結 論

采用常見的單糖、雙糖、低聚糖分別與蛋白胨和酵母膏組合，篩選出蛹蟲草發酵的最適碳氮源分別為蔗糖和蛋白胨。以蛹蟲草發酵產物中的菌絲體產量為指標，選取pH 值、接種量、搖床轉速3 個因素，通過中心組合（Box-Benhnken）試驗原理進行三因素三水平的響應面試驗優化發酵條件，得到最佳發酵工藝為pH 值6.39，接種量6.61%，搖床轉速178.07 r/min，此時菌絲體產量為29.40 g/L。