蛹蟲草液體發酵菌絲體工藝條件的優化*

王 坤 曲亮璠 王祥河 劉 然 許勤虎

1（天津市工業微生物研究所有限公司，天津 300462）2（天津量信檢驗認證技術有限公司，天津 300462）3（天津實發中科百奧工業生物技術有限公司，天津 300462）

冬蟲夏草（Cordyceps sinensis）是我國名貴的中藥材，其宿主蝙蝠蛾幼蟲對生長環境的要求極為嚴苛，難以實現規模化飼養。野生冬蟲夏草資源緊缺，價格昂貴，尋求野生蟲草的替代品逐漸成為人們研究的熱點。蛹蟲草（Cordyceps militaris）是一種藥食兩用真菌，與冬蟲夏草具有相似的化學成分和生物活性。研究表明，蛹蟲草內核苷、多糖、甘露醇及甾醇類物質具有抗疲勞、抗衰老、抗病毒、抗氧化、抗腫瘤、降三高以及調節免疫系統等藥理作用。對蛹蟲草進行合理的開發利用，能夠滿足人們日益增長的保健需求，具有良好的商業價值和廣闊的市場空間。目前，我國蛹蟲草的人工種植技術已經取得了一定的進展，由于該菌種極易受其他微生物污染，使產品品質降低，影響經濟效益。蛹蟲草菌絲體液體發酵的方法具有速度快、周期短、產量高、控制條件容易等特點，可以突破氣候、環境等因素的限制，避免不利因素對菌種發酵造成的負面影響，適合大規模工業化生產。在真菌發酵過程中，獲得大量的生物體是各種功效成分高效積累的基礎。目前，維生素B 族對蛹蟲草液體發酵的影響鮮有報道，本研究通過正交工藝優化在一定程度上提高了該菌種菌絲體的產量，旨在為蛹蟲草資源的科學研究和開發應用提供依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試菌株：蛹蟲草（Cordyceps militaris），菌種編號：CICC 14013。

蔗糖、蛋白胨、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素B12等均為分析純。

1.2 儀器與設備

AE200 分析天平，Seven Multi pH 計，梅特勒-托利多集團；GZX-9146 MBE 數字鼓風干燥箱，上海博迅實業有限公司；MLS-3750 高壓滅菌鍋，三洋電氣公司；SHB-Ⅲ循環水式多用真空泵，鄭州長城科工貿有限公司；SW-CJ-2F 型雙人雙面凈化工作臺，蘇州凈化設備有限公司。

1.3 方法

1.3.1 蛹蟲草液體發酵試驗

1.3.1.1 液體菌種的制備

斜面培養基：馬鈴薯200.0 g/L，葡萄糖20.0 g/L，瓊脂20.0 g/L。

液體菌種培養基：蔗糖40.0g/L，蛋白胨20.0g/L，硫酸鎂1.0 g/L，磷酸二氫鉀1.0 g/L。

取1 cm2大小斜面菌種接入500 mL 的錐形瓶中，裝液量為200 mL/瓶，搖床轉速180 r/min，溫度22 ℃，培養5 d。

1.3.1.2 發酵單因素試驗

選取不同磷酸二氫鉀、硫酸鎂添加量（0.5 g/L、1.0 g/L、1.5 g/L、2.0 g/L、2.5 g/L）；不同維生素B1、B2、B6、B12添加量（10 mg/L、20 mg/L、30 mg/L、40 mg/L、50 mg/L），蔗糖40.0 g/L，蛋白胨30.0 g/L，接種量7.5%，搖瓶裝液量100/250 mL，pH 6.5，搖床轉速180 r/min，22 ℃培養6 d。以蛹蟲草發酵產物中的菌絲體生物量為指標，進行單因素試驗。

1.3.1.3 正交試驗

在上述單因素試驗的基礎上，進行四因素三水平正交優化試驗，以獲得蛹蟲草液體發酵的最佳條件和最大菌絲體產量。

1.3.2 菌絲體生物量測定方法

菌絲體的生物量采用細胞干重法測定，將發酵產物置于布氏漏斗進行抽濾，棄去濾液，用蒸餾水將菌絲體洗凈后，重復上述試驗操作，將得到的菌絲體置于60 ℃烘干至恒重。生物量按下式計算：

式中：X——生物量，g/L；

W——細胞干重，g；

V——取樣體積，mL。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗結果

2.1.1 磷酸二氫鉀添加量對菌絲體產量的影響

磷酸二氫鉀添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響如圖1 所示。無機鹽是微生物菌體組成的一部分，也是一些酶的激活劑或者抑制劑，除此之外，還能夠調節液體培養基中的pH 值、氧化還原電位和滲透壓。鉀元素雖然不參與細胞結構物質的組成，但能改變微生物細胞內膜結構的通透性，能夠調節細胞的滲透壓；磷元素是微生物細胞內蛋白質和核酸類物質合成的必要成分。隨著磷酸二氫鉀質量濃度的增加，蛹蟲草菌絲體干重呈現先升高后降低的趨勢，當磷酸二氫鉀質量濃度達到1.5 g/L 時，搖瓶液體發酵獲得的生物量達到最大值，為27.24 g/L，比對照組提高了51.33%。

圖1 磷酸二氫鉀添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響

2.1.2 硫酸鎂添加量對菌絲體產量的影響

硫酸鎂添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響如圖2 所示。雖然無機鹽在微生物細胞中的含量很少，但是能對其生長速度和代謝產物產生一定的影響。鎂是生物體內不可或缺的元素，鎂離子能夠激活微生物細胞體內多種酶的活性，能促進碳水化合物的新陳代謝、核酸的合成、磷酸鹽的轉化等。硫元素是蛋白質的重要組成成分，其重要性僅次于磷，對微生物的生長發育有著至關重要的作用。隨著液體培養基中硫酸鎂質量濃度從0.5 g/L 上升至2.5 g/L，菌絲體的生物量呈現先升高后降低的趨勢，菌絲體干重分別為22.12 g/L、23.15 g/L、23.82 g/L、26.33 g/L、24.50 g/L，相比于對照組的菌絲體干重20.90 g/L 分別提高了5.83%、10.77%、13.97%、25.98%、17.22%，當硫酸鎂質量濃度達到2.0 g/L時，蛹蟲草液體發酵的菌絲體生物量達到最大值。

圖2 硫酸鎂添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響

2.1.3 維生素B1添加量對菌絲體產量的影響

維生素B1添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響如圖3 所示。大多數維生素是微生物生長代謝過程中某些酶的輔酶，在物質代謝中起重要作用。維生素B1廣泛存在于生物體體內，參與某些糖和脂肪的代謝過程，在代謝旺盛的位置含量最高。在一定的濃度范圍內，添加維生素B1可以顯著促進蛹蟲草菌絲體的生長，獲得更高的產量。當維生素B1的添加量為30 mg/L 時，液體發酵所得生物量最高，達到26.07 g/L，較對照組提高了11.84%。因此，維生素B1的最適添加量為30 mg/L。

圖3 維生素B1 添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響

2.1.4 維生素B2添加量對菌絲體產量的影響

維生素B2添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響如圖4 所示。維生素B2參與微生物體內的能量代謝，與碳水化合物、蛋白質、核酸和脂肪的生化反應息息相關，是許多動物和微生物生長的必需因素。對照組搖床震蕩培養發酵6 d 后，菌絲體生物量為23.52 g/L，在10 mg/L～50 mg/L 的添加范圍內，其生物量分別為23.27 g/L、23.91 g/L、24.08 g/L、23.14 g/L、24.25 g/L。試驗結果表明，維生素B2對蛹蟲草生物量沒有顯著性的影響，該菌種對維生素B2生長因子添加量的變化不敏感。

圖4 維生素B2 添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響

2.1.5 維生素B6添加量對菌絲體產量的影響

圖5 維生素B6 添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響

維生素B6添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響如圖5 所示。維生素B6主要以磷酸吡多醛（PLP）形式參與近百種酶反應，多數與氨基酸代謝有關：包括轉氨基、脫羧、側鏈裂解、脫水及轉硫化作用。對照組搖床震蕩培養發酵6 d 后，生物量為23.81 g/L，維生素B6在一定程度上能夠促進對蛹蟲草菌絲體的生長和繁殖。當培養基中維生素B6質量濃度為40 mg/L 時，菌絲體產量較對照組提高了6.93%，此時促進作用最為明顯。

2.1.6 維生素B12 添加量對菌絲體產量的影響

維生素B12添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響如圖6 所示。維生素B12又稱鈷胺素，參與氨基酸和胸腺嘧啶的合成，能夠促進微生物的生長發育。在一定的范圍內，添加較低濃度的維生素B12（＜30 mg/L）對蛹蟲草菌絲體生長的促進作用較為明顯，能夠獲得更高的生物量。當維生素B12的添加量為30 mg/L時，發酵所得生物量最多，達到26.17 g/L，較對照組菌體產量23.54 g/L 提高了11.17%。隨著液體培養基中維生素B12含量進一步增加，菌絲體的生物量逐漸降低。因此，維生素B12的最適添加量為30 mg/L。

圖6 維生素B12 添加量對蛹蟲草菌絲體產量的影響

2.2 正交試驗結果

2.2.1 試驗因素與水平

根據單因素試驗結果，選取對蛹蟲草液體發酵菌絲體產量影響較大的磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B12添加量這4 個因素，以發酵產物中菌絲體干重為指標進行L9(34)的正交試驗，正交因素與水平見表1，試驗方案及結果見表2。

表1 正交試驗因素與水平設計

2.2.2 正交試驗結果與分析

表2 正交試驗結果

由表2 可知，磷酸二氫鉀、硫酸鎂、維生素B1、維生素B12添加量對蛹蟲草液體發酵菌絲體的生物量均有顯著性影響，極差值分別為1.833、1.776、0.836、1.486，4 個因素對其響應值的影響主次順序為：磷酸二氫鉀添加量＞硫酸鎂添加量＞維生素B12添加量＞維生素B1添加量。最佳發酵條件為：磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂2.0 g/L，維生素B130 mg/L，維生素B1230 mg/L。

2.2.3 優化條件的驗證

表3 驗證試驗結果

由正交試驗優化出蛹蟲草發酵菌絲體的最佳工藝（A2B2C2D2）并未在正交試驗表中出現，所以需要進行驗證試驗，試驗結果如表3 所示。液體發酵培養基中磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂2.0 g/L，維生素B130 mg/L，維生素B1230 mg/L時，蛹蟲草菌絲體干重達到28.23 g/L，高于各試驗組所得數據，說明工藝優化試驗有效。

3 結 論

蛹蟲草菌株可以利用多種B 族維生素作為生長因子。在液體培養基中添加維生素B1、維生素B6、維生素B12能夠顯著提高菌絲體的生物量；而添加維生素B2對蛹蟲草菌絲生物量的影響不顯著。

以蛹蟲草液體發酵菌絲體的生物量為優化指標，通過四因素三水平正交試驗優化蛹蟲草菌絲體發酵工藝，得到最佳發酵條件為：磷酸二氫鉀1.5 g/L，硫酸鎂2.0 g/L，維生素B130 mg/L，維生素B1230 mg/L，此時菌絲體產量為28.23 g/L。