PINK1沉默對(duì)肺癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

申秋菊，趙靜，王二雄，白曉瑞

(榆林市第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科，陜西 榆林 719000)

肺癌是高死亡率的癌癥之一，約占所有癌癥死亡人數(shù)的1/5[1]。目前，手術(shù)切除、放射治療及化學(xué)治療仍是其最常見的治療方法，但療效并不理想，患者5年生存率僅為15%[1-2]。因此，迫切需要尋求一種新的更為有效的肺癌治療方法。PTEN誘導(dǎo)激酶1(PTEN induced putative kinase 1，PINK1)在腫瘤的發(fā)生和發(fā)展中起著至關(guān)重要的作用，可通過介導(dǎo)功能障礙的線粒體募集，進(jìn)而促進(jìn)受損線粒體通過自噬作用消除[3]，并和Parkin蛋白一起，在細(xì)胞凋亡中發(fā)揮重要作用。對(duì)乳腺癌和宮頸癌細(xì)胞的研究[4]顯示，PINK1敲低可顯著抑制癌癥相關(guān)表型，并阻斷癌細(xì)胞的細(xì)胞周期進(jìn)程。同時(shí)，PINK1下調(diào)可增加非小細(xì)胞肺癌對(duì)順鉑的敏感性[5]。此外，近期Yamashita等[6]的研究證明，高表達(dá)的PINK1可能會(huì)導(dǎo)致食管鱗狀細(xì)胞癌患者的化療耐藥性和不良預(yù)后。雖然這些研究已經(jīng)闡明了PINK1在多種癌細(xì)胞中的作用，但PINK1在肺癌中的詳細(xì)機(jī)制還尚未完全清楚。本研究采用特異性PINK1-短發(fā)夾RNA(shRNA)沉默肺癌細(xì)胞中PINK1的表達(dá)，探討PINK1沉默在肺癌細(xì)胞增殖、凋亡和線粒體功能障礙中的作用。

1 材料與方法

1.1 試劑與設(shè)備

人肺癌細(xì)胞系H2106購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)，shRNA-對(duì)照質(zhì)粒和shRNA-PINK1質(zhì)粒由上海生工生物工程股份有限公司提供及合成，pENTRTM/H1/TO載體和脂質(zhì)體2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，遺傳霉素購(gòu)自美國(guó) Sigma-Aldrich公司，MTT試劑盒、細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海碧云天公司，線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1法)試劑盒、線粒體提取試劑盒、活性氧(ROS)測(cè)定試劑盒購(gòu)自南京建成生物工程研究所，BCA試劑盒、RIPA試劑、Bax抗體、Bcl-2抗體、GAPDH抗體、二抗購(gòu)自上海碧云天公司，PINK1抗體和活性caspase3抗體購(gòu)自美國(guó)Abcam公司，F(xiàn)ACS Calibur流式細(xì)胞儀由美國(guó)BD公司生產(chǎn)，imark酶標(biāo)儀由美國(guó)伯樂公司提供。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)、分組及轉(zhuǎn)染 (1)細(xì)胞培養(yǎng)：將人肺癌細(xì)胞置于含有10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中，于37 ℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞鋪滿瓶底后，采用0.25%的胰酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；(2)細(xì)胞分組：將細(xì)胞分為空白組(未轉(zhuǎn)染質(zhì)粒)、陰性組(轉(zhuǎn)染shRNA-對(duì)照質(zhì)粒)和轉(zhuǎn)染組(轉(zhuǎn)染shRNA-PINK1質(zhì)粒)。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將shRNA-PINK1基因或shRNA-對(duì)照基因分別克隆進(jìn)pENTRTM/H1/TO載體中構(gòu)建pENTRTM/H1/TO-shRNA-PINK1(簡(jiǎn)稱shRNA-PINK1質(zhì)粒)和pENTRTM/H1/TO-shRNA-對(duì)照(簡(jiǎn)稱shRNA-對(duì)照質(zhì)粒)重組質(zhì)粒，然后采用脂質(zhì)體2000將shRNA-PINK1質(zhì)粒(轉(zhuǎn)染組)或者shRNA-對(duì)照質(zhì)粒(陰性組)轉(zhuǎn)染至H2106細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染48 h后，將150 g/mL的遺傳霉素加入轉(zhuǎn)染組和陰性組的細(xì)胞培養(yǎng)基中。2周后，篩選穩(wěn)定表達(dá)PINK1干擾載體的H2106細(xì)胞；空白組不做處理。人shRNA-PINK1基因的序列為：5′-CACC GCTGGAGGAGTATCTGATA TTCAAGAGA TATCAGATACTCCTCCAGC-3′，shRNA-對(duì)照基因的序列為：5′-CACC GCTAGGATATGGTCGGATA TTCAAGAGA TATCCGACCATATCCTAGC-3′。

1.2.2 細(xì)胞增殖抑制率檢測(cè) 將各組細(xì)胞以5103/孔的密度接種于96孔板，每組8孔。設(shè)空白孔，只加RPMI-1640培養(yǎng)基。分別于轉(zhuǎn)染后0、6、12、24、48和72 h，加入5 mg/mL的MTT溶液20 L，反應(yīng)4 h，用快速翻板法去除培養(yǎng)基，加200 L的DMSO，振蕩10 min，30 min后用酶標(biāo)儀在490 nm處檢測(cè)吸光值(OD)。細(xì)胞增殖抑制率(%)=[(空白孔OD值-待測(cè)孔OD值)/空白孔OD值]100%。

1.2.3 細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡檢測(cè) 收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，加入1 mL 細(xì)胞固定液，吹打混勻，在4 ℃固定24 h。用PBS洗去固定液，1 000 rpm離心5 min，用0.5 mL的PBS重懸細(xì)胞。加入0.5 mL PI，室溫避光孵育30 min，用流式細(xì)胞儀在激發(fā)波長(zhǎng)488 nm處檢測(cè)每組處于各細(xì)胞周期的細(xì)胞所占的百分比。收集轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞，加入5 L AnnexinV-FITC，混勻，室溫避光孵育10 min，離心收集沉淀，重懸后加入10 L PI，室溫避光孵育15 min，用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4 Western Blot檢測(cè)PINK1、活性caspase3、Bax和Bcl-2等蛋白表達(dá)水平 用RIPA試劑從轉(zhuǎn)染48 h后的各組細(xì)胞中分離總蛋白，采用BCA試劑盒進(jìn)行總蛋白定量。采用10% SDS-PAGE分離總蛋白，轉(zhuǎn)膜后用5%的BSA封閉45 min，分別加入PINK1、活性caspase3、Bax和Bcl-2一抗，37℃孵育4 h；加入各自二抗(1∶5000)，室溫?fù)u床孵育1 h后，ECL暗室發(fā)光。采用凝膠成像系統(tǒng)和Quantity One 4.6.2軟件(美國(guó)Bio-Rad公司)對(duì)條帶進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。內(nèi)參為GAPDH。蛋白相對(duì)表達(dá)量=檢測(cè)蛋白的灰度值/GAPDH的灰度值。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 各組細(xì)胞增殖抑制率的對(duì)比

在轉(zhuǎn)染12、24、48和72 h時(shí)，轉(zhuǎn)染組細(xì)胞增殖抑制率均高于空白組和陰性組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組與陰性組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖1。

2.2 各組細(xì)胞周期和凋亡率對(duì)比

與空白組和陰性組對(duì)比，轉(zhuǎn)染組S期細(xì)胞數(shù)量降低、G2/M期細(xì)胞數(shù)量增加、細(xì)胞凋亡率降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，空白組與陰性組比較，各期細(xì)胞和細(xì)胞凋亡率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05，表1)。

表1 各組細(xì)胞周期和凋亡率對(duì)比

*P<0.05，與空白組和陰性組相比。

2.3 各組PINK1等蛋白表達(dá)水平對(duì)比

與空白組和陰性組對(duì)比，轉(zhuǎn)染組活性caspase3和Bax表達(dá)水平增加、PINK1和Bcl-2表達(dá)降低(P<0.05)，空白組與陰性組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見圖2和表2。

表2 各組PINK1等蛋白表達(dá)水平對(duì)比

分組PINK1active caspase3BaxBcl-2空白組(n=8)0.87±0.1040.42±0.1150.26±0.0830.51±0.096陰性組(n=8)0.92±0.0840.38±0.0890.29±0.0900.56±0.124轉(zhuǎn)染組(n=8)0.33±0.050*1.16±0.132*1.47±0.146*0.20±0.079*

*P<0.05，與空白組和陰性組相比。

3 討論

PINK1在肺癌細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)癌細(xì)胞惡性增殖以及化療耐藥性[6]。本研究采用RNA干擾技術(shù)，將shRNA-PINK1質(zhì)粒轉(zhuǎn)染入人肺癌細(xì)胞H2106中沉默PINK1，借以探討PINK1沉默對(duì)肺癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期、細(xì)胞凋亡等的影響。

本研究結(jié)果顯示，PINK1沉默可顯著增加肺癌細(xì)胞的增殖抑制率。其原因可能是PINK1可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和線粒體功能，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的發(fā)展[3]，也可以說，PINK1為促腫瘤因子，而其沉默將可能導(dǎo)致腫瘤生長(zhǎng)抑制。結(jié)果還顯示，PINK1沉默后，G2/M期的細(xì)胞構(gòu)成比顯著增加，而S期細(xì)胞構(gòu)成比降低。G2為有絲分裂的準(zhǔn)備期，M期為有絲分裂期，G2/M期細(xì)胞構(gòu)成比增加表示細(xì)胞有絲分裂進(jìn)入延遲，細(xì)胞可能在修復(fù)S期累積的DNA損傷。有研究[7]證實(shí)，在wee1蛋白缺乏的情況下，將導(dǎo)致細(xì)胞沒有完成DNA修復(fù)就直接進(jìn)入有絲分裂期，但在進(jìn)入有絲分裂期后，G2/M期的DNA檢查點(diǎn)將會(huì)發(fā)出不利于分裂的信號(hào)(由于DNA修復(fù)未完成)。因此，導(dǎo)致細(xì)胞在G2/M期滯留，有絲分裂未啟動(dòng)。這可能是PINK1沉默導(dǎo)致肺癌細(xì)胞增殖抑制的原因之一。

細(xì)胞凋亡逃逸是癌細(xì)胞的一個(gè)顯著特征，且越來越多的研究[8]表明，PINK1在多種細(xì)胞模型中具有抗凋亡作用。因此，本研究試圖探討PINK1沉默在肺癌細(xì)胞凋亡中的作用，結(jié)果顯示，PINK1沉默能顯著增加肺癌細(xì)胞的凋亡率，其機(jī)制可能與PINK1沉默降低肺癌細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)、提高Bax蛋白表達(dá)及caspase-3活化有關(guān)。Bax和Bcl-2蛋白均是內(nèi)在線粒體依賴性細(xì)胞凋亡的關(guān)鍵參與者，Bax為促凋亡蛋白，會(huì)加速細(xì)胞凋亡過程，反之Bcl-2為抗凋亡蛋白，會(huì)阻止細(xì)胞凋亡過程[9]。Caspase-3是caspase家族之一，是促凋亡蛋白，可由線粒體依賴的內(nèi)在凋亡途徑和死亡受體觸發(fā)的外源性凋亡途徑激活[10]。據(jù)此推測(cè)，由caspase-3及Bax/Bcl-2啟動(dòng)的線粒體依賴凋亡途徑可能也是PINK1沉默促進(jìn)肺癌細(xì)胞凋亡的原因之一。

綜上，PINK1沉默可抑制肺癌細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，PINK1可能是肺癌治療的另一個(gè)新靶點(diǎn)。