胃癌中miR-216a表達的變化及其對胃癌細胞侵襲的靶向調控作用

茍蘭瓊，何平，鄭連喜，陳宗萬，屈敏，楊科，弓達秀

(1.攀鋼集團總醫院腫瘤科，四川 攀枝花 617023；2.唐山市人民醫院，河北 唐山 063001)

胃癌是我國最常見的消化道惡性腫瘤之一，發病率高、治愈率低、整體預后較差[1-2]。腫瘤的遠處轉移是影響胃癌病情轉歸的重要因素，而癌細胞的侵襲是造成腫瘤轉移的重要病理環節，但目前胃癌細胞調控的機制并未完全闡明。微小RNA(miRs)是一類在轉錄后水平調節基因表達的小分子非編碼RNA，通過改變靶基因的表達來產生相應的生物學效應。近年來，多種miRs被證實參與抑癌基因、原癌基因表達的調控并且與多種惡性腫瘤的發生發展有關。miR-216a是一種具有抑癌活性的miRs，在肺癌、結直腸癌、宮頸癌等惡性腫瘤病灶內均被證實呈低表達趨勢[3-5]。本實驗通過對胃癌中miR-216a表達的變化及其對胃癌細胞侵襲的靶向調控作用的研究，探尋其在胃癌發生發展中所起的作用及潛在作用機制。

1 資料與方法

1.1 資料

1.1.1 病例資料 胃癌組織和癌旁組織取自2015年3月至2018年10月唐山市人民醫院接受手術切除的38例胃癌患者。其中，男性23例，女性15例；年齡42～65歲，平均年齡(51.38±9.82)歲；患者術前均未接受過放化療且經術后病理證實為胃癌。患者簽署知情同意書，并報院倫理委員會批準。

1.1.2 實驗材料 SGC7901細胞株購自中科院上海細胞資源中心，miR-216a模擬物及對應的陰性對照(NC)模擬物購自上海吉凱公司，miR-216a表達檢測試劑盒購自北京天根公司，Transwell小室購自Corning公司，Matrigel膠購自B&D公司，結晶紫購自上海碧云天公司，MMP2、MMP9、N-cadherin、p-JAK2、p-STAT3的第一抗體購自Abcam公司。超純RNA提取試劑盒、SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒、UltraSYBR Mixture(Low ROX)試劑盒購自北京康為世紀公司。

1.2 方法

1.2.1 miR-216a的檢測 取胃癌組織和癌旁組織，采用miRNA提取試劑盒提取組織中的miRNA后采用miRNAcDNA第一鏈合成試劑盒將miRNA合成為對應的cDNA，采用miRNA熒光定量PCR檢測試劑盒對cDNA中的miR-216a進行擴增，根據擴增曲線計算miR-216a的表達量。

1.2.2 細胞培養及轉染 SGC7901用含有100 mL/L胎牛血清的DMEM在37 ℃、5%CO2、飽和濕度的環境中培養，細胞匯合至90%后常規用胰蛋白酶消化傳代，傳代后的細胞接種在培養板內并進行轉染。NC組轉染NC的模擬物、miR-216a組轉染miR-216a的模擬物。

1.2.3 細胞侵襲的檢測 胰蛋白酶消化后的SGC7901細胞調節至2×105/mL，取0.2 mL接種在Transwell小室的上室內，下室內加入含有100 mL/L胎牛血清的DMEM 0.8 mL，轉染不同模擬物后24 h、48 h，用棉簽擦去半透膜上未發生穿膜的細胞，取下半透膜并用4%多聚甲醛固定30 min，而后用0.1%結晶紫染色20 min，在顯微鏡下觀察并對穿膜細胞進行計數。

1.2.4 基因蛋白表達的檢測 SGC7901細胞接種在6孔培養板內，轉染不同模擬物后48 h，棄去培養基、保留細胞，加入蛋白裂解液后提取細胞內的蛋白樣本，而后將蛋白樣本加入聚丙烯酰胺凝膠中，依次完成電泳、電轉膜、5%脫脂牛奶室溫封閉2 h、1:1 000第一抗體4 ℃孵育過夜、1:1 000第二抗體室溫孵育2 h，最后曝光得到蛋白條帶，根據條帶的灰度值計算蛋白表達量。

1.2.5 基因mRNA表達的檢測 SGC7901細胞接種在6孔培養板內，轉染不同模擬物后48 h，棄去培養基、保留細胞，采用超純RNA提取試劑盒提取細胞中的RNA，采用SuperRT cDNA第一鏈合成試劑盒將RNA反轉錄為cDNA，最后使用UltraSYBR Mixture(Low ROX)試劑盒配置PCR反應體系，對cDNA中的MMP2、MMP9、N-cadherin、JAK2、STAT3進行擴增，根據擴增曲線計算mRNA表達量。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 miR-216a在胃癌組織和癌旁組織中的表達

熒光定量PCR檢測證實，胃癌組織和癌旁組織中miR-216a的表達量分別為(0.41±0.09)和(0.83±0.14)，胃癌組織中miR-216a的表達量明顯低于癌旁組織，差異有統計學意義(t=5.643、P=0.001)。見圖1。

2.2 不同病理特征胃癌組織中miR-216a表達的比較

TNM分期III期胃癌中miR-216a的表達量明顯低于TNM分期I-II期胃癌，低未分化胃癌中miR-216a的表達量明顯低于中高分化胃癌，有淋巴結轉移的胃癌中miR-216a的表達量明顯低于無淋巴結轉移的胃癌，差異有統計學意義(P<0.05)。見表1。

2.3 miR-216a對SGC7901細胞侵襲的影響

Transwell模型檢測SGC7901細胞穿膜數證實，轉染后24 h、48 h，miR-216a組SGC7901細胞的穿膜數明顯少于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖2和表2。Western blot檢測證實，轉染后48 h，miR-216a組SGC7901細胞中MMP2、MMP9、N-cadherin的表達量均明顯低于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖3、表3和表4。

病理特征例數miR-216at值P值TNM分期 I-II220.56±0.119.2120.001 III160.28±0.06分化程度 中高分化200.64±0.1312.8630.001 低未分化180.22±0.05淋巴結轉移 否230.60±0.1210.9730.001 是150.24±0.05

表2 兩組間SGC7901細胞穿膜數的比較

組別24 h48 hNC組(n=5)89.31±12.41125.48±20.19MiR-216a組(n=5)62.75±9.2988.58±12.58t值3.8313.469P值0.0050.008

組別MMP2MMP9N-cadherinNC組(n=5)1.08±0.180.98±0.130.91±0.15MiR-216a組(n=5)0.41±0.070.62±0.090.68±0.08t值7.7575.0913.025P值0.0010.0010.016

組別MMP2MMP9N-cadherinNC組(n=5)0.92±0.150.97±0.171.03±0.17MiR-216a組(n=5)0.55±0.070.61±0.080.67±0.09t值11.7524.2854.185P值0.0000.0030.003

2.4 miR-216a對SGC7901細胞中JAK2/STAT3通路的影響

Western blot檢測證實，轉染后48 h，miR-216a組SGC7901細胞中p-JAK2、p-STAT3的表達量均明顯低于NC組，差異有統計學意義(P<0.05)。見圖4、表5和表6。

組別p-JAK2p-STAT3NC組(n=5)0.89±0.130.97±0.15MiR-216a組(n=5)0.68±0.100.44±0.07t值 2.8637.160P值0.0210.001

組別JAK2STAT3NC組(n=5)0.91±0.181.03±0.21MiR-216a組(n=5)0.55±0.070.65±0.08t值 4.1683.781P值0.0030.005

3 討論

胃癌細胞侵襲所造成的病灶遠處轉移是導致晚期胃癌患者生存率較低的重要因素，探明胃癌細胞侵襲的調控機制有助于為靶向治療手段的研發提供依據。miRs在惡性腫瘤增殖、遷移、侵襲等惡性生物學行為的調控中起到重要作用，與靶基因mRNA的3’非翻譯區結合后能夠抑制mRNA向蛋白質的翻譯過程，進而在轉錄后水平實現對基因表達的調控并通過不同基因表達的變化來產生不同的生物學效應。在諸多與惡性腫瘤相關的miRs中，miR-216a是一類具有抑癌活性的miRs，在多種惡性腫瘤病灶內均被證實呈低表達趨勢[3-5]。

近年來也有細胞實驗[6-8]證實，miR-216a能夠靶向調控乳腺癌、腎癌、卵巢癌等多種惡性腫瘤細胞的侵襲。本研究結果顯示，胃癌組織中miR-216a的表達量明顯低于癌旁組織，提示低表達的miR-216a與胃癌的發生有關。結合miR-216a對多種癌細胞侵襲的靶向調控作用推測，胃癌中低表達的miR-216a可能靶向促進癌細胞的侵襲、增加miR-216a的表達則能抑制癌細胞的侵襲。

為了進一步驗證上述關于miR-216a在胃癌細胞中生物學效應的推測，miR-216a的模擬物被轉染進入胃癌細胞株SGC7901中，通過miR-216a的模擬物來增強miR-216a的生物學功能后檢測了細胞的侵襲情況。MMP2、MMP9是MMPs家族的重要成員，在胃癌中的高表達能夠促進細胞外基質的水解并使細胞不斷向鄰近組織侵襲[9-10]；N-cadherin是間質表型標志物，在胃癌中的高表達能夠使細胞間黏附性和極性減弱，進而有利于癌細胞向鄰近組織運動[11]。本研究結果顯示，miR-216a組的穿膜細胞數少于NC組，細胞中侵襲基因MMP2、MMP9、N-cadherin的蛋白表達及mRNA低于NC組，表明miR-216a對胃癌細胞的侵襲具有抑制作用。

胰腺癌中關于MiR-216a調控癌細胞侵襲的實驗[12]證實，細胞中直接受到miR-216a靶向調控的基因是JAK2/STAT3信號通路，該信號通路是具有促增殖、促侵襲作用的通路，信號分子以磷酸化的形式發生激活后能夠在細胞核內啟動MMP2、MMP9、N-cadherin等侵襲基因的表達，進而通過侵襲基因的生物學效應來促進細胞侵襲[13-14]。本研究結果顯示，miR-216a組細胞中p-JAK2、p-STAT3的蛋白表達量及JAK2、STAT3的mRNA表達量均明顯低于NC組，提示胃癌細胞中JAK2/STAT3信號通路直接受到miR-216a的靶向調控，miR-216a通過抑制JAK2/STAT3信號通路來抑制胃癌細胞的侵襲及細胞中多種侵襲基因的表達。見圖5。

綜上所述，胃癌中miR-216a的低表達能夠靶向促進胃癌細胞的侵襲且該作用與JAK2/STAT3信號通路有關，miR-216靶向調控JAK2/STAT3信號通路的機理如圖5所示。本研究能夠為深入探究胃癌侵襲的調控機制及相應的靶向治療藥物提供參考依據。