蟲草素聯(lián)合吉西他濱對乳腺癌細(xì)胞凋亡的影響及機制

樊華 朱永軍 趙永鋒

(山西中醫(yī)藥大學(xué) 1中醫(yī)臨床學(xué)院西外教研室，山西 太原 030001；2附屬醫(yī)院乳腺科)

乳腺癌治療主要以外科手術(shù)和化療為主〔1，2〕。吉西他濱常用于治療非小細(xì)胞肺癌、乳腺癌、卵巢癌等〔3～5〕。但由于其毒性和不良反應(yīng)較多，且患者易出現(xiàn)耐藥性，導(dǎo)致化療藥物治療效果不佳。目前臨床治療癌癥已逐漸采用聯(lián)合用藥的治療方式，以期提高療效的同時減少化療藥物的耐藥性和對機體的毒副作用〔6〕。蟲草素是中藥冬蟲夏草的天然產(chǎn)物，具有廣泛的抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物學(xué)活性〔7〕。蟲草素作為抗腫瘤的中藥之一，在乳腺癌、肝癌、結(jié)直腸癌等多種腫瘤中表現(xiàn)出較強的抗腫瘤能力〔8～10〕。蟲草素在體外能夠阻滯腫瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗腫瘤作用。中藥聯(lián)合化療藥物的聯(lián)合用藥的方式已成為目前治療腫瘤的研究熱點〔11〕，本實驗采用中藥蟲草素聯(lián)合化療藥物吉西他濱作用于人乳腺癌MCF-7細(xì)胞，觀察對細(xì)胞、增殖、凋亡及細(xì)胞周期的影響，并對其作用機制進(jìn)行初步探討。

1 材料與方法

1.1材料 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞株購于美國ATCC公司；蟲草素購于大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度>98%；吉西他濱購于江蘇奧賽康藥業(yè)股份有限公司；RPMI1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；0.25%胰蛋白酶、胎牛血清購于賽默飛世爾科技有限公司；膜聯(lián)蛋白(Annexin)Ⅴ-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒購于日本TaKaRa公司；噻唑藍(lán)(MTT)試劑、二喹啉甲酸(BCA)蛋白濃度檢測試劑盒購于上海碧云天生物科技有限公司；超敏電化學(xué)發(fā)光(ECL)試劑盒購于大連寶生物工程有限公司；蛋白激酶B(Akt)信號通路激活劑胰島素樣生長因子(IGF)-1購于美國Gibco公司；活化型含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Cleaved Caspase-3)抗體、Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bax)抗體購于武漢艾美捷科技有限公司；甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)抗體、Akt抗體、磷酸化(p)-Akt抗體購于美國Cell Signaling公司。

1.2乳腺癌細(xì)胞培養(yǎng) 將人乳腺癌MCF-7細(xì)胞在無菌操作條件下置于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基(含100 μg/ml鏈霉素、100 U/ml青霉素)中，培養(yǎng)條件為37℃，5%CO2，飽和濕度，每隔2 d更換1次新鮮的培養(yǎng)液，待細(xì)胞生長匯合度至80%時，以0.25%胰蛋白酶消化傳代，每2～3 d傳代1次。

1.3MTT法檢測MCF-7細(xì)胞增殖能力 人乳腺癌MCF-7細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)生長期時，以0.25%的胰蛋白酶消化細(xì)胞，將細(xì)胞以5×105個/孔接種于96孔培養(yǎng)板中，置于37℃恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。將細(xì)胞隨機分為4組，蟲草素組，加入含蟲草素濃度為0.8 g/L的培養(yǎng)液；吉西他濱組，加入含吉西他濱濃度為10 μmol/L的培養(yǎng)液；聯(lián)合用藥組，加入含0.8 g/L蟲草素和10 μmol/L吉西他濱的培養(yǎng)液；對照組，不含藥物的等量培養(yǎng)液。每組設(shè)置6個復(fù)孔，分別培養(yǎng)24、48、96 h后檢測細(xì)胞增殖抑制率，即在每孔細(xì)胞中添加20 μl濃度為5 g/L的MTT溶液，于37℃培養(yǎng)箱中孵育4 h，除去上清液，再分別在每孔細(xì)胞中添加150 μl二甲基亞砜溶液，置于震蕩儀上，避光孵育10 min，待結(jié)晶物完全溶解后用全自動酶標(biāo)儀在490 nm處檢測每孔細(xì)胞的吸光度值，計算每組細(xì)胞增殖抑制率，細(xì)胞增殖抑制率=(1-實驗組/對照組)×100%，每組實驗重復(fù)3次取均值。

1.4流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡情況 取對數(shù)生長期的乳腺癌MCF-7細(xì)胞，將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×105個/ml，分別按照1.3方法加入藥物處理各組細(xì)胞48 h后，分別收集各組細(xì)胞，1 000 r/min離心5 min，棄上清，用預(yù)冷的固定液重懸細(xì)胞，細(xì)胞固定后緩慢加入預(yù)冷的95%的乙醇，調(diào)整乙醇終濃度為75%，置冰上孵育30 min。然后分別加入1 ml終濃度為50 μg/ml的碘化丙啶(PI)和RNA酶，染色1 h后，以流式細(xì)胞儀檢測各組MCF-7細(xì)胞周期分布和細(xì)胞凋亡情況。

1.5Western印跡檢測MCF-7細(xì)胞中蛋白表達(dá)水平 乳腺癌MCF-7細(xì)胞經(jīng)含蟲草素、吉西他濱、聯(lián)合用藥的培養(yǎng)液干預(yù)48 h后，用細(xì)胞刮收集細(xì)胞，將收集的細(xì)胞中加入預(yù)冷的裂解液，置冰上裂解，提取各組細(xì)胞中總蛋白，用BCA蛋白定量檢測試劑盒對所提取的蛋白進(jìn)行濃度定量測定。各組蛋白樣品取等量蛋白(約50 μg)用12%十二烷基硫酸鈉(SDS)-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離蛋白后，采用濕轉(zhuǎn)法將凝膠上的蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上，在含5%脫脂奶粉的封閉液中孵育4 h，4℃過夜孵育一抗(均為1∶1 000倍稀釋)，室溫孵育二抗(1∶3 000倍稀釋)2 h，ECL法檢測，凝膠成像儀掃描圖像，采用Image J圖像分析系統(tǒng)分析各條帶灰度值，以GAPDH為內(nèi)參，相對灰度值表示MCF-7細(xì)胞蛋白表達(dá)水平。

1.6Akt信號通路激活劑對MCF-7細(xì)胞凋亡的影響 以終濃度為50 ng/ml的 Akt信號通路激活劑IGF-1作用于聯(lián)合用藥組MCF-7細(xì)胞，處理48 h后，以流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡情況。方法同1.4。

1.7統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行單因素方差分析及SNK-q檢驗、獨立樣本t檢驗。

2 結(jié) 果

2.1各組細(xì)胞增殖抑制情況率比較 與對照組比較，蟲草素組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率明顯升高(P<0.05)。與蟲草素組和吉西他濱組比，聯(lián)合用藥組細(xì)胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)。見表1。

表1 各組細(xì)胞增殖抑制率比較

與對照組比較:1)P<0.05；與聯(lián)合用藥組比較:2)P<0.05；下表同

2.2各組細(xì)胞凋亡情況比較 與對照組比較，蟲草素組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯增加，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平明顯升高(P<0.05)。與蟲草素組和吉西他濱組比，聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率顯著增加，細(xì)胞中Cleaved Caspase-3和Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高(均P<0.05)。見圖1、圖2、表2。

圖1 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組MCF-7細(xì)胞凋亡率

2.3各組細(xì)胞周期 與對照組比較，蟲草素組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組G0～G1期細(xì)胞明顯增多，S期細(xì)胞明顯減少(均P<0.05)，吉西他濱組和蟲草素組G2～M期細(xì)胞明顯增加(均P<0.05)。與蟲草素組和吉西他濱組比較，聯(lián)合用藥組G0～G1期細(xì)胞顯著增多，S期和G2～M期細(xì)胞顯著減少(均P<0.05)。見表3。

2.4各組Akt信號通路激活水平 與對照組比較，蟲草素組、吉西他濱組及聯(lián)合用藥組p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低(均P<0.05)。與蟲草素組和吉西他濱組比較，聯(lián)合用藥組p-Akt蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)。各組Akt蛋白表達(dá)量差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見圖3、表4。

2.5激活MCF-7細(xì)胞中Akt信號通路可部分緩解細(xì)胞凋亡 與聯(lián)合用藥組比較，IGF-1+聯(lián)合用藥組細(xì)胞凋亡率明顯降低〔(53.13±4.24)%vs(33.24±3.57)%，P<0.05〕。見圖4。

圖2 Western印跡檢測各組Cleaved Caspase-3、Bax蛋白表達(dá)

組別凋亡率(%)Cleaved Caspase-3Bax對照組1.26±0.090.21±0.020.45±0.05蟲草素組25.84±1.181)2)0.61±0.051)2)0.96±0.101)2)吉西他濱組34.04±1.621)2)0.70±0.061)2)0.92±0.111)2)聯(lián)合用藥組51.67±2.951)1.26±1.331)1.77±0.191)

表3 各組細(xì)胞周期比率比較

圖3 Western印跡檢測Akt、p-Akt蛋白表達(dá)

組別Aktp-Akt對照組1.06±0.090.31±0.03蟲草素組1.05±0.080.19±0.021)2)吉西他濱組1.05±0.100.15±0.021)2)聯(lián)合用藥組1.02±0.090.02±0.011)

圖4 流式細(xì)胞術(shù)檢測MCF-7細(xì)胞凋亡率

3 討 論

隨著醫(yī)學(xué)的發(fā)展，開展了對乳腺癌的篩查和綜合治療，使得乳腺癌的死亡率有所降低，但并未取得較大改善。究其原因是乳腺癌極易發(fā)生轉(zhuǎn)移和侵襲，在對乳腺癌進(jìn)行化療過程中患者易產(chǎn)生耐藥性，加之化療藥物的毒副作用較大，嚴(yán)重影響乳腺癌的治療和預(yù)后〔12〕。蟲草素能夠在體外呈濃度依賴性的誘導(dǎo)人腎癌ACHN細(xì)胞凋亡，抑制細(xì)胞增殖〔13〕。Yu等〔14〕研究顯示蟲草素處理非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞后，經(jīng)檢測發(fā)現(xiàn)蟲草素可將細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，上調(diào)p53、p21等的表達(dá)導(dǎo)致細(xì)胞損傷增加，并提高細(xì)胞凋亡率。都興范等〔15〕研究發(fā)現(xiàn)蟲草素對人乳腺癌細(xì)胞MCF-7具有一定的抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用。吉西他濱是一種新型的脫氧胞苷類似物，能夠有效抑制DNA修復(fù)和脫氧核苷酸的生成〔16〕。吉西他濱通過誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡發(fā)揮抗癌作用〔17,18〕。本實驗結(jié)果顯示，蟲草素和吉西他濱單用藥時均能夠抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，阻滯細(xì)胞周期處于G0～G1期，上調(diào)Cleaved Caspase-3和Bax蛋白水平。聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，可增強抑制細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的作用。這說明蟲草素和吉西他濱聯(lián)合用藥具有協(xié)同增效的作用。本實驗發(fā)現(xiàn)單用藥和聯(lián)合用藥組Akt蛋白磷酸化水平顯著降低，提示Akt信號通路的活化受到抑制。Akt信號通路在介導(dǎo)腫瘤的生長和發(fā)展中具有重要作用，Akt蛋白磷酸化能夠促進(jìn)存活蛋白表達(dá)的上調(diào)，存活蛋白可抑制凋亡蛋白的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡受到抑制〔19,20〕。因此，Akt通路的活化能夠抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡〔21〕。蟲草素能夠通過抑制Akt信號通路的激活同時激活p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路誘導(dǎo)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡〔22〕。Wang等〔23〕研究顯示，蟲草素通過抑制Akt信號通路上調(diào)Caspase蛋白活性誘發(fā)人急性單核細(xì)胞白血病細(xì)胞凋亡。Jing等〔24〕研究指出，吉西他濱能夠通過抑制Akt信號通路促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞中Bax蛋白的表達(dá)，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)，激活Caspase-3和Caspase-9誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。天花粉蛋白通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)/Akt途徑增強吉西他濱對非小細(xì)胞肺癌A549細(xì)胞毒性和凋亡誘導(dǎo)作用〔25〕。本實驗蟲草素和吉西他濱單用藥和聯(lián)合用藥處理人乳腺癌MCF-7細(xì)胞能夠抑制Akt信號通路的激活，提示二者及聯(lián)合用藥誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡與Akt信號通路的活化有關(guān)。為進(jìn)一步研究藥物誘導(dǎo)MCF-7細(xì)胞凋亡的作用機制與Akt信號通路有關(guān)，本實驗在聯(lián)合用藥組MCF-7細(xì)胞中施加Akt信號通路激活劑IGF-1，經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測發(fā)現(xiàn)，Akt信號通路激活劑IGF-1能夠部分緩解由聯(lián)合用藥導(dǎo)致的細(xì)胞凋亡。驗證了蟲草素聯(lián)合吉西他濱對乳腺癌細(xì)胞凋亡的誘發(fā)與Akt信號通路的活化有關(guān)。

綜上，蟲草素和吉西他濱聯(lián)合使用能夠有效抑制人乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖，阻滯細(xì)胞周期，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，具有協(xié)同增效的作用，其分子機制有Akt信號通路的活化有關(guān)。為蟲草素和吉西他濱聯(lián)合用藥的乳腺癌臨床治療提供一定的實驗基礎(chǔ)。