CD133+和CD133-膠質母細胞瘤腫瘤干細胞的lncRNA表達譜

陳竹 周太光 薛麗 陳佳

(1西南醫科大學臨床醫學院，四川 瀘州 464000；綿陽市中心醫院 2兒科；3檢驗科)

腦膠質瘤是最常見的顱內原發性腫瘤，約占顱內原發性腫瘤總數的70%，其中膠質母細胞瘤(GBM)是惡性程度最高的組織學類型，具有發病率高、復發率高、死亡率高和治愈率低的特點〔1〕。近年來，無論是顯微手術、放化療還是免疫治療均取得了巨大進步，但GBM患者的預后仍不理想。2016年，世界衛生組織(WHO)整合了分子分型的膠質瘤分型系統，在原有組織學基礎上加入了分子分型，優化了原有的基于組織病理學的分型系統，新分型將GBM患者分為異檸檬酸脫氫酶(IDH)野生型與IDH突變型，前者約占90%，表明在這一分型標準下患者之間仍存在較大的異質性，目前急需分子層面的更精準的分層診斷與治療〔2〕。研究表明在人類GBM內存在GBM干細胞(GSC)亞群〔3～5〕，Lan等〔6〕發現腫瘤增殖異質性是由同種群的GSC及其GSC后代隨機突變所決定，表明腫瘤干細胞不僅驅動著腫瘤的發生、發展及復發，還決定著腫瘤細胞之間的異質性。研究發現GBM經多次培養分離獲得的具有自我更新能力的腫瘤干細胞，表現出兩種不同的生物行為學表現，一類表現為高增殖指數，形成典型神經球狀生長，免疫組化顯示CD133+；另一類表現為相對較低的增殖，形成黏附生長球伴隨有分化細胞，免疫組化顯示CD133-〔7〕。

隨著大規模的二代測序技術應用，越來越多的腫瘤驅動基因被發現，推動了膠質瘤的分子分型的發展〔8，9〕。此外，深度的測序技術還發現了一類新分子，即長鏈非編碼(lnc)RNA，在膠質瘤的發生、發展中也起到重要作用〔10，11〕。LncRNA是一類長度超過200 bp，缺乏開放閱讀框架的mRNA樣轉錄本，多種lncRNA被報道與膠質瘤相關。如經典的同源框(HOX)轉錄反義RNA(HOTAIR)，其高表達與GBM的不良預后相關，并可通過表觀遺傳學、miR-141等途徑調控髓細胞增生原癌基因(C-myc)的激活，推進腫瘤的發展〔12～14〕。本研究旨在探索CD133+和CD133-兩類腫瘤干細胞在轉錄水平上的差異，并分析了lncRNA 長鏈脂肪酸延伸酶2翻譯RNA(ELOVL2-AS1)的臨床意義。

1 材料和方法

1.1材料 32例GBM組織標本取自西南醫科大學附屬醫院，臨床標本均經病理檢驗證實，患者均簽署知情同意書，本研究經本院倫理委員會審核通過，并持續定期隨訪。標本于手術后迅速轉移至液氮保存。從腫瘤基因組圖譜計劃(TCGA)下載具有完整臨床資料及二代RNA測序表達譜資料的GBM患者共149例。

1.2LncRNA的重注釋 在GEO數據庫(https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)下載GDS2728數據集下的GBM表達譜原始數據(cel格式文件)，標準化和背景校正使用RobustMultichip Average法(RMA，Windows版)，并使用GAT Explorer〔15〕對其進行重注釋，提取其中的lncRNA，形成表達譜。

1.3實時熒光定量-聚合酶鏈反應(qRT-PCR) 取于液氮中保存的膠質瘤組織0.1～0.2 g，RNeasy mini kit(Qiagen公司，德國)提取總RNA，于-80℃保存，按照PrimeScript RT reagent (TaKaRa公司)使用說明，反轉錄合成cDNA，隨后使用SYBR Premix Ex TaqⅡ (Tli RNaseH Plus；TaKaRa公司)進行PCR反應，ELOVL2-AS1引物：上游：5′-AGGACATAGTGAGAAGGT-3′，下游：5′-ATCAAGTTGCCAGAAGAG-3′，CD133引物：上游：5′-GTCCTCTTCTCTTCTCAA-3′，下游：5′-CTCTGTCCATATTCTCCAT-3′，由Invitrogen公司合成。

1.4共表達網絡構建 構建基于加權基因共表達網絡分析(WGCNA)方法的共表達網絡，相較于一般的Pearson相關系數網絡構建，該方法更符合一般生物基因表達模式〔16，17〕。將軟閾值設定為0.99，并使用K中心值法鑒定共表達網絡中的核心轉錄本，K值越大說明轉錄本越重要。

1.5統計學分析 差異lncRNA的分析采用R軟件的limma包，采用SPSS24.0軟件進行t檢驗、Pearson相關系數檢驗，Kaplan-Meier法繪制生存曲線，組間比較進行Log-Rank檢驗。

2 結 果

2.1來源于原發GBM的CD133+和CD133-腫瘤干細胞的差異基因表達譜 共計1 250個差異表達的轉錄本，其中差異表達的lncRNA為151個(差異倍數≥1，P<0.05，見圖1A)，CD133+組相對CD133-組上調的轉錄本為638個，下調612個。聚類熱圖顯示，CD133+與CD133-GBM干細胞的mRNA和lncRNA表達譜存在顯著差異(圖1B、1C)。

A:CD133+組表達圖；B:所有差異表達的轉錄本的聚類熱圖；C:差異倍數在前50的lncRNA聚類熱圖圖1 GBM CD133+與CD133-腫瘤干細胞差異基因表達譜

2.2差異表達基因的功能分析 Beier等〔7〕研究發現上述兩類腫瘤干細胞之間存在顯著的生物行為學上的差異，為初步探索差異基因所主導的功能差異，本研究使用基因本體論(GO)分析了差異基因的主要功能〔錯誤發現率(FDR)<0.05〕，見表1，發現CD133+組下調基因最富集的GO條目為主要組織相容性復合體(MHC)Ⅱ類蛋白復合體〔18，19〕。

2.3lncRNA/mRNA的共表達網絡 轉錄調控網絡中諸多轉錄本相互作用形成了復雜的互作網絡，具有相近功能的基因具有類似的基因表達形式。基于該理論，共表達網絡通過可視化的方法有效地易化了該轉錄調控網絡，并有助于提取出關鍵轉錄本。通過WGCNA分析，本研究構建了共表達網絡(圖2A)，該網絡包含1 148個節點及3 237對關系構成，并形成了數個重要的子網絡。最重要的子網絡已被突出顯示，該子網絡內的節點均具有最高的K值，應為該調控網絡的核心子網絡，該子網絡內包含凸素(PROM)1基因即CD133，進一步證實了CD133在兩種不同生物學特性的腫瘤干細胞之間的調控網絡中具有重要的調控作用。磷脂轉運蛋白(PLTP)是具有最高K值的lncRNA，在該調控網絡中處于重要地位(圖2B)。

表1 差異表達基因富集的GO條目(%)

A：基于WGCNA的差異基因共表達網絡，圖中重點展示了K值大于14的核心子網絡，該子網絡包含CD133基因；B：共表達網絡中K值排名前30的轉錄本圖2 差異轉錄本的共表達網絡及網絡核心基因分析

2.4LncRNA ELOVL2-AS1在GBM中的臨床意義探究 為進一步明確lncRNA ELOVL2-AS1在GBM中的臨床意義，首先對隨訪時間<30 d的TCGA患者進行撿剔，在剩余142例患者中分析了該lncRNA的臨床意義，平均(60.97±12.70)歲，男91例，女51例。IDH突變患者的ELOVL2-AS1表達水平較低(P<0.001)，其他臨床資料下的患者無顯著統計學意義(P>0.05)，見表2。ELOVL2-AS1高表達患者中位總生存時間顯著低于低表達患者(10.87個月 vs 12.21個月，P=0.025)，見圖3A。納入年齡、性別進行校正，并建立風險積分模型：風險得分=0.031×年齡(歲)+0.362×ELOVL2-AS1(0：低表達，1：高表達)。

隨后，本研究使用qRT-PCR檢測了2015～2018年本院收治的32例GBM患者的ELOVL2-AS1與CD133的表達水平，平均(57.2±8.70)歲，男20例，女12例。ELOVL2-AS1與CD133表達呈中度相關(Pearson相關系數=0.618，P=0.000)，見圖3B。風險積分高者中位生存時間顯著低于低得分者(6.21個月vs 13.31個月，P=0.02)，見圖3C。

表2 142例TCGA來源GBM患者ELOVL2-AS1表達與臨床資料分析

A：在142例TCGA的GBM患者中，高、低表達ELOVL2-AS1組的生存曲線；B：經PCR檢測的32例GBM患者中ELOVL2-AS1與CD133的相關性；C：32例GBM患者基于前述風險積分公式的不同風險評分組的預后單因素分析圖3 lncRNA ELOVL2-AS1的臨床意義

3 討 論

由于腫瘤細胞的異質性，腫瘤細胞逐漸獲得的耐藥性仍是目前腫瘤治療領域的一大難題。研究認為，腫瘤干細胞是導致耐藥的主要誘因，通過靶向腫瘤干細胞可有效地控制腫瘤〔20〕。CD133是一種包含5次跨膜區域的糖蛋白，被認為可作為多種癌癥的腫瘤干細胞標記物〔21～23〕，但同時也有研究表明腫瘤干細胞全能性并不一定受限于CD133+，甚至CD133-細胞的集落生成能力要強于前者〔24〕。

早在2004年，Singh等〔25〕就使用CD133作為標志物，成功從成神經管細胞瘤和膠質瘤中獲取了腫瘤干細胞。近年Beier等〔7〕研究發現，原發GBM經培養可獲得CD133+和CD133-兩種細胞集落，兩種細胞集落均有腫瘤特性，所不同的是CD133+細胞呈現神經球樣生長，與之相對應的CD133-集落包含多種分化細胞，呈現黏附生長特性，且前者的增殖及遷移能力顯著強于后者。臨床研究進一步證實了上述結論，CD133可作為腦腫瘤患者預后總生存及無病生存的預測指標〔26～29〕。

基因芯片分析揭示了CD133+和CD133-細胞之間調控基因的差異。通過對表達譜的初步分析，本研究發現了MHCⅡ類分子在CD133-細胞上高表達，可能與腫瘤細胞的免疫及細胞黏附相關，一定程度解釋了其黏附生長的特點。在顯著差異表達的lncRNA中，不乏近年來被證實在膠質瘤的發生、發展中起到重要作用的lncRNA，如lncRNA H19，被證實可通過調控miR-675的表達，進而負調控靶基因Cadherin 13的表達，影響膠質瘤細胞的侵襲和遷移能力〔30，31〕。

脂代謝異常與腫瘤的增殖、轉移有著密切的聯系。研究發現“轉移起始細胞”對脂質代謝有著極強依懶性并表達高活性CD36受體，從而有效攝取脂肪酸〔32〕。ELOVL基因的諸多成員與腫瘤的發生、發展密切相關，如ELOVL7可促進前列腺腫瘤細胞的增殖〔33〕，ELOVL6的高表達可致乳腺癌、肝癌的不佳預后〔34，35〕。ELOVL2-AS1是通過構建共表達網絡獲取的在CD133+腫瘤干細胞中顯著高表達的關鍵lncRNA，理論上可順式調控其對應靶mRNA，ELOVL2是長鏈脂肪酸合成的限速酶之一，涉及多種多不飽和脂肪酸的合成〔36，37〕。該基因通過調節細胞內脂質代謝，在乳腺癌、結腸癌與前列腺癌中發揮重要調控作用〔38～40〕。

本研究提示了ELOVL2-AS1作為風險預測因子及CD133相關調控網絡的可能。但ELOVL2-AS1調節ELOVL2基因進而調節脂質代謝，參與CD133+腫瘤干細胞的驅動，影響患者預后這一假設有待進一步研究證實。