酶解輔助提取桑黃粗多糖的工藝優化

史玉寶，白衛東，趙文紅，錢 敏，白永亮

（1.廣西藥用植物園，廣西 南寧 530023；2.仲愷農業工程學院，廣東 廣州 510225）

桑黃屬珍稀藥用真菌，因其通常生長在桑屬植物上，子實體顏色鮮黃而得名。最早記載于《藥性論》，之后歷代本草學中多有記載，其味甘辛、無毒，用于治療血崩、血淋、脫肛瀉血、帶下、經閉[1]。目前開發的桑黃原料主要是子實體[2]和菌絲體[3]，主要活性物質為多酚類物質[4]、黃酮類化合物[5]和多糖[6]，還含有萜類化合物、甾醇類、香豆素類、吡喃酮類、呋喃類和氯化產物等多種活性成分[7-9]。其中，研究較多的是桑黃多糖，結果表明桑黃多糖具有抗腫瘤[10-13]、增強免疫[14]、抗氧化[15]、抗炎[16-17]和降血糖等作用[18-20]。

由于桑黃資源稀少，開發較晚，國內外對桑黃多糖的研究尚處于初步階段。目前，關于桑黃多糖提取方法的研究主要集中在熱水法[21]、超聲輔助法[22-24]、復合酶輔助法[25]、發酵法[26-27]、低溫低壓法[28]和微波提取法[29-30]。桑黃子實體中的多糖是構成真菌細胞壁的主要成分，與纖維素、蛋白質等緊密結合在一起，不易分離。目前，國內外對桑黃多糖的提取研究報道較多，酶解輔助提取技術較其他的方法更高效節能。試驗在對比了不同蛋白酶的酶解效果基礎上，選取了木瓜蛋白酶進行酶解提取工藝的優化。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

（1）桑黃子實體。采自長白山國家自然保護區，經鑒定后粉碎過篩備用；木瓜蛋白酶（60×104U/g），南寧龐博生物工程有限公司提供；其他試劑均為化學純或分析純。

（2）6%苯酚溶液。精確稱取6 g重蒸苯酚，置于100 mL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。

（3）木瓜蛋白酶。精確稱取0.2 g的木瓜蛋白酶粉末，溶解，置于100 mL量瓶中，用蒸餾水定容至刻度。

（4）DNS試劑。酒石酸鉀鈉182 g，溶于500 mL蒸餾水中，加熱（不超過50℃），于熱溶液中依次加入3,5-二硝基水楊酸6.3 g，NaOH21 g，苯酚5 g，無水亞硫酸鈉5 g，攪拌均勻，冷卻后用蒸餾水定容至1 000 mL，貯于棕色瓶中，室溫下放置7 d后使用。

1.2 儀器與設備

BS110S型精密電子天平，北京賽多利斯天平有限公司產品；HH-4型數顯恒溫水浴鍋，金壇市富華儀器有限公司產品；SHZ-D(Ⅲ)型循環水式真空抽濾機，鞏義市英峪予華儀器廠產品；752N型紫外線可見光光度計，上海精密科學儀器有限公司產品。

1.3 試驗方法

1.3.1 還原糖的測定——DNS法

精確稱取105℃干燥恒質量的標準葡萄糖50 mg，定容于100 mL容量瓶，配制成質量濃度為0.5 mg/mL的標準葡萄糖標準溶液。按表1添加試劑于10 mL具塞試管，沸水浴5 min，然后迅速流水冷卻，定容至10 mL，于波長540 nm處測定吸光度。以葡萄糖質量濃度為縱坐標，以吸光度為橫坐標，繪制還原糖標準曲線，還原糖標準曲線的回歸方程為：Y=0.354 9X+0.015 6，R2=0.999 3，其中Y為葡萄糖質量濃度，X為吸光度。

還原糖標準曲線的試劑用量見表1。

表1 還原糖標準曲線的試劑用量/mL

1.3.2 總糖含量的測定——硫酸—苯酚法

精確稱取105℃干燥恒質量的標準葡萄糖100 mg，定容于100 mL容量瓶，配置成質量濃度為1 mg/mL的標準葡萄糖母液，取上述母液10 mL于100 mL容量瓶中，配置成質量濃度為0.1 mg/mL的葡萄糖標準溶液。

按表2添加試劑后，振蕩混勻，于室溫下放置30 min，于波長490 nm處測定OD值，做3個平行，求平均值。以葡萄糖質量濃度為縱坐標，以吸光度為橫坐標，繪制標準曲線，多糖標準曲線的回歸方程為：Y=0.163 7X-0.003 8，R2=0.999 1，其中Y為葡萄糖質量濃度，X為吸光度。

總糖標準曲線的試劑用量見表2。

表2 總糖標準曲線的試劑用量/mL

1.3.3 多糖含量的測定

多糖含量=總糖含量-還原糖含量.

吸取樣品液1.0 mL，按上述步驟操作，測光密度，按回歸方程求出樣品溶液中總糖含量。

吸取樣品液2.0 mL，按上述步驟操作，測光密度，按回歸方程求出樣品溶液中還原糖含量。

1.3.4 工藝流程

桑黃子實體干燥粉碎→過目（60目）→酶解→滅酶→→抽濾→上清液→測定多糖含量。

1.3.5 桑黃多糖單因素提取條件研究

（1）酶添加量的選擇。稱取5份桑黃樣品各1 g，在確定的料液比、提取時間和提取溫度的條件下，分別于按照0.1%，0.2%，0.3%，0.4%，0.5%添加木瓜蛋白酶進行提取，測定提取液中粗多糖的質量濃度，比較酶添加量對多糖提取率的影響。試驗重復3次。

（2）提取溫度的選擇。稱取5份桑黃樣品各1 g，在確定的料液比、提取時間和酶添加量的條件下，分別于不同溫度如30，40，50，60，70℃下提取，測定提取液中粗多糖的質量濃度，比較提取溫度對多糖提取率的影響。試驗重復3次。

（3）料液比的選擇。稱取5份桑黃樣品各1 g，在確定的提取時間、提取溫度和酶添加量的條件下，分別按照不同料液比1∶10，1∶20，1∶30，1∶40，1∶50進行提取，測定提取液中粗多糖的質量濃度。比較料液比對多糖提取率的影響。試驗重復3次。

（4）提取時間的選擇。稱取5份桑黃樣品各1 g，在確定的料液比、提取溫度和酶添加量的條件下，分別選用不同的提取時間20，40，60，80，100 min，測定提取液中粗多糖的質量濃度，比較提取時間對多糖提取率的影響。試驗重復3次。

1.3.6 正交試驗

根據單因素的試驗結果，確定木瓜蛋白酶的添加量為0.3%，用正交試驗對酶解時間、酶解溫度和料液比進行三因素三水平的正交試驗，每組條件下取桑黃樣品1 g，分別用酶解提取3次，確定粗多糖的質量濃度。

正交試驗因素與水平設計見表3。

2 結果與分析

2.1 單因素試驗

表3 正交試驗因素與水平設計

2.1.1 木瓜蛋白酶添加量對多糖提取率的影響

木瓜蛋白酶添加量對多糖提取率的影響見圖1。

圖1 木瓜蛋白酶添加量對多糖提取率的影響

由圖1可知，在木瓜蛋白酶添加量小于0.3%時，提取率隨添加量的增加而迅速提高，在大于0.3%時，提取率變化不明顯，趨于平穩。說明在木瓜蛋白酶的添加量達到0.3%時，酶對反應物的催化作用逐漸達到飽和，再增加酶的添加量，也是增加酶的消耗量，而對反應沒有太大影響。所以選擇木瓜蛋白酶的最佳添加量為0.3%。

2.1.2 提取溫度對多糖提取率的影響

提取溫度對多糖提取率的影響見圖2。

圖2 提取溫度對多糖提取率的影響

由圖2可知，提取率先隨著溫度的提高不斷提高，提取溫度為50℃時提取率達到最大，說明在較低溫度時，木瓜蛋白酶的活性隨著溫度的升高而增大。高于50℃后，總體提取率降低，且呈現不規律的波動現象，但差異不顯著。這可能可能由于溫度超出了木瓜蛋白酶的活性范圍，酶發生變性或者活力下降，從而使酶催化反應不能正常進行。所以在其他條件一定時，選擇50℃為最佳提取溫度。

2.1.3 料液比對多糖提取率的影響

料液比對提取率有顯著的影響，選擇的比例過大，會減少了酶與底物作用的幾率，比例過小，有關溶劑的用量和能耗都會大量增加。

料液比對多糖提取率的影響見圖3。

圖3 料液比對多糖提取率的影響

由圖3可知，隨著物料濃度的減小，多糖提取率先上升后下降，提取率在料液比為1∶30時最大。因此，選擇最佳料液比為1∶30。

2.1.4 提取時間對多糖提取率的影響

提取時間對多糖提取率的影響見圖4。

圖4 提取時間對多糖提取率的影響

由圖4可知，提取時間對多糖提取率有明顯的影響，隨著提取時間延長多糖提取率先升高后降低，在提取時間為60 min時提取率達到最大。說明在提取時間小于60 min時，隨反應的進行提取出的多糖增多。而在提取時間大于60 min時，在提取完全后，隨著加熱的繼續進行，使反應產物多糖發生降解，從而使反應產生的產物變少。因此，選擇最佳提取時間為60 min。

2.2 正交試驗優化

正交試驗結果見表4。

通過正交試驗結果直觀分析，由R值可知，所選因素對桑黃多糖提取率的影響由大到小依次為提取時間＞提取溫度＞料液比。最優工藝為A1B2C3，即提取時間40 min，提取溫度50℃，料液比1∶40。采用優化工藝參數條件進行驗證試驗，經過3次重復試驗，平均提取率達到1.52%，且表明該工藝較穩定。

3 結論

桑黃子實體中粗蛋白含量達到5.48%，是多糖含量的2倍多，菌絲體中粗蛋白更是達到36.46%[31]。脫除蛋白的桑黃多糖才能更好地進行相關研究，有利于桑黃多糖的純化工藝和結構分析。目前已有很多研究通過各種方法（Sevag法、三氯醋酸法和三氯醋酸與酶結合法）除去桑黃粗多糖提取液的蛋白，以進行下一步的純化分析。但是這些方法各有優缺點，如在酸性條件脫除蛋白可能會影響桑黃多糖的活性[31-33]。因此，如果在桑黃多糖提取的過程中通過酶解的方法除去粗蛋白或與多糖結合的蛋白，可為后續工作提供便利，節約能源。試驗在對比了多種蛋白酶的酶解效果基礎上，選取了木瓜蛋白酶進行酶解輔助提取工藝優化。在單因素試驗的基礎上，經正交試驗優化分析，確定了酶解輔助提取桑黃多糖的工藝參數為木瓜蛋白酶添加量0.3%，提取時間40 min，提取溫度50℃，料液比1∶40（g∶mL）。以期為桑黃多糖的提取、純化、結構測定及藥理活性的研究奠定一定的技術基礎。

表4 正交試驗結果