miR-142-3p表達對卵巢癌 SKOV3細胞生長和轉移的影響

陸曉云，張斌，佟芳

（ 大連醫科大學附屬第一醫院 1. 婦產科； 2. 腫瘤科，遼寧 大連 116011）

卵巢癌是女性常見的具有較高惡性程度的腫瘤，5年生存率僅為25%～35%［1］。卵巢癌的發病機制復雜，復發率高，雖然目前卵巢癌治療取得了明顯的進展，但其長期預后差。因此了解卵巢癌的發病機制可以為臨床治療提供理論基礎。高遷移率族蛋白A2 （high mobility group protein A2，HMGA2） 是一類結構轉錄因子，在很多腫瘤中過表達，在卵巢癌組織中也過表達，可能與腫瘤的轉移有關［2］。HMGA2可以通過蛋白質-DNA或者蛋白質-蛋白質相互作用調節多個基因來發揮作用。HMGA2作為腫瘤蛋白在很多癌癥 （乳腺癌、食管鱗狀癌、結直腸癌和卵巢癌等） 中表達上調［3-6］，但HMGA2在卵巢癌中的調控機制仍不清楚。

微小RNA （microRNA，miRNA） 是一類長度約22個核苷酸小分子的非編碼 RNA，它通過與靶基因mRNA的3’非翻譯區結合而抑制靶基因轉錄，進而終止基因翻譯［7］。有研究［8］報道miRNA 在很多種類腫瘤中表達異常，發揮著致癌或抑制癌癥的作用。研究［9］發現 miR-142-3p在結直腸癌中表達降低。本研究擬分析miR-142-3p在卵巢癌組織中的表達，并探討 miR-142-3p對卵巢癌SKOV3細胞生長和轉移的影響。

1 材料與方法

1.1 卵巢癌標本與試劑

收集2017年8月至2018年7月大連醫科大學附屬第一醫院婦產科40例卵巢癌女性患者的卵巢癌組織標本，患者年齡30～75歲，平均年齡61.5歲。其中20例患者取癌旁正常組織 （癌邊緣2.5～3.5 cm） 放入準備好的凍存管，保存于液氮里。臨床病例資料完整，病理診斷和分期，組織分化程度等均有相關證據。試劑包括人卵巢癌細胞株SKOV3 （中國醫學科學院細胞中心）、DMEM培養基 （美國Hyclone公司）、 Trizol與轉染所用脂質體 （美國invitrogen公司）、miR-142-3p引物與U6 引物 （大連寶生物工程有限公司合成）、miR-142-3p和HMGA2模擬物及對照序列 （大連寶生物工程有限公司合成）。

1.2 細胞培養與轉染

SKOV3細胞使用DMEM培養基 （含10%新生胎牛血清），在5%CO2、 37 ℃、95%濕度下培養。將miRNA-空白對照 （miR-NC） 或miR-142-3p、HMGA2模擬物轉染至人卵巢癌細胞株SKOV3，細胞培養24 h后留作后續實驗。

1.3 細胞Transwell 測定

用miR-142-3p模擬物或HMGA2過表達載體轉染細胞或用miR-142-3p抑制劑預處理細胞。48 h后細胞在血清剝奪培養基中培養12 h，用胰蛋白酶消化，然后接種在24孔透孔培養基 （Promega） 的頂部培養室中。在培養基中加入20%血清作為下腔的化學吸引劑。24 h后用4%甲醛固定細胞10 min，然后用0.005%結晶紫染色，相差顯微鏡下計數。

1.4 實時熒光定量PCR測定

取約0.2 g組織，放入有少許液氮的研缽中，加入Trizol研碎，提取總RNA，mRNA逆轉錄，以U6為內參，進行PCR 反應。實驗中所用的引物序列如下：HMGA2上游引物：5’-CTCAAAAGAAAGCAGAAGC CACTG-3’，反向引物：5’-TGAGCAGGCTCTTCTGAA CAACT-3’；miR-142-3p莖環引物 5’-CTCAACTGGTG TCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGTCCATAAA-3’，上游引物：5’ -CTCCAGCTGGGTGTAGTGTTTCCTAC TT -3’，反向引物：5’ -GTCGTGGAGTCGGCAAT-3’；U6 莖環引物 5’-GTCGTATCCAGTGCAGGGTCCGAG GTATTCGCACTGGATACGACAAAATATGGAAC- 3’，上 游 引 物：5’-TGCGGGTGCTCGCTTCGGCAG C-3’，反向引物：5’-CCAGTGCAGGGTCCGAGGT-3’。

1.5 Western blotting

在細胞培養皿加入蛋白裂解液，用槍頭反復抽打，裂解20 min后，將蛋白裂解液移至1.5 mL EP管中，4 ℃高速離心15 min后取上清液，采用BCA法檢測樣品蛋白濃度，用裂解液配平。加入5×上樣緩沖液煮沸，進行蛋白變性8 min。上樣進行電泳，濃縮膠80 V 40 min，分離膠120 V 80 min，轉膜 100 V 60 min，將蛋白轉移到PVDF膜上。5% 脫脂奶粉封閉1 h后，一抗anti-HMGA2 （1∶500，美國Santa Cruz公司）、GAPDH （1∶2 000，美國Santa Cruz公司） 4 ℃孵育過夜；室溫TBST洗3次，5 min/次，加入HRP兔抗二抗 （1∶1 000），室溫孵育1 h；TBST洗3次，5 min/次；ECL發光液發光。計算成像后蛋白條帶灰度值。

1.6 統計學分析

2 結果

2.1 miR-142-3p在卵巢癌組織的表達情況

結果顯示，miR-142-3p在卵巢癌組織表達為0.42±0.12，癌旁正常組織表達為0.98±0.15，二者比較有統計學差異 （P ＜ 0.01）。 HMGA2在卵巢癌組織的表達為 0.97±0.13，癌旁正常組織的表達為0.52±0.16，二者比較有統計學差異 （P ＜ 0.01）。Pearson相關分析表明卵巢癌組織中miR-142-3p表達與HMGA2 mRNA表達呈負相關 （r = -0.707 4，P ＜ 0.05）。利用Target Scan 和mi Target等軟件進行生物學分析，結果發現miR-142-3p與HMGA2的3’-UTR結合，見圖1。

2.2 miR-142-3p過表達抑制SKOV3細胞的遷移和侵襲

圖1 miR-142-3p靶基因預測結果Fig.1 Prediction of target genes of miR-142-3p

采用miR-142-3p過表達載體 （miR-142-3p模擬物） 轉染SKOV3細胞，或用miR-142-3p的抑制劑預處理48 h。結果顯示，與miR-142-3p模擬物交叉感染后，miR-142-3p表達顯著增加；而抑制劑預處理明顯抑制了miR-142-3p表達 （表1）。在Transwell實驗中，miR-142-3p過表達導致SKOV3細胞遷移和侵襲顯著抑制；與干擾組比較，miR-142-3p抑制劑處理增強了SKOV3細胞遷移和侵入。見表1、圖2。本研究結果表明，體外miR-142-3p表達增強對卵巢癌細胞遷移和侵襲具有抑制作用。

表1 3組細胞中miR-142-3p mRNA表達以及SKOV3細胞遷移、侵襲情況比較Tab.1 Expression of miR-142-3p mRNA and SKOV3 ovarian cancer cell migration and invasion among three groups

圖2 miR-142-3p抑制卵巢癌SKOV3細胞的遷移和侵襲 ×400Fig.2 miR-142-3p inhibits migration and invasion of ovarian cancer SKOV3 cells ×400

2.3 HMGA2逆轉miR-142-3p引起的細胞遷移和侵襲

為了確定HMGA2是否參與了miR-142-3p對腫瘤細胞的作用，本研究構建了HMGA2過表達載體，并成功導入SKOV3 細胞中。Western blotting檢測結果表明，過表達載體轉染后，SKOV3細胞中HMGA2表達顯著增加。上調HMGA2顯著逆轉了miR-142-3p誘導的遷移和侵襲抑制，見表2、圖3。證實HMGA2參與了miR-142-3p介導的卵巢癌細胞生長調節。

2.4 過表達miR-142-3p降低HMGA2的表達

表2 HMGA2表達上調后SKOV3細胞遷移和侵襲結果比較Tab.2 Comparison of migration and invasion of SKOV3 cells after up-regulation of HMGA2 expression

結果顯示，對照組、NC組、模擬組SKOV3細胞中HMGA2 mRNA表達分別為1.0±0.11， 1.0±0.09，0.4±0.03。與對照組比較， 模擬組SKOV3細胞中HMGA2 mRNA表達明顯下調 （P ＜ 0.05） ；HMGA2蛋白表達也明顯下調，見圖4。

圖3 HMGA2過表達抑制miR-142-3p誘導的細胞遷移和侵襲×400 Fig.3 Overexpression of HMGA2 inhibits miR-142-3p induced cell migration and invasion ×400

圖4 SKOV3細胞中HMGA2蛋白表達Fig.4 HMGA2 protein expression in SKOV3 cells

3 討論

研究［10］顯示，卵巢癌生存率較低，可能與卵巢癌惡性程度及復雜的生物學特征有關。很多腫瘤形成的相關因子與卵巢癌的發展有關，但其發病機制仍未闡明［11］。miR-142發現于造血細胞［12］，DUDEK等［13］研究結果表明，mir-142-3p是一種新的β-連環蛋白抑制劑，有可能是未來腫瘤治療的候選靶點。有研究［14］報道在子宮頸癌細胞中miR-142-3p 能夠通過作用FZD7 抑制細胞的增殖和侵襲。

miR-142-3p作為抑癌因子在多種腫瘤組織或細胞系中表達下調，本研究比較了卵巢癌患者標本與癌旁組織中miR-142-3p表達水平，發現miR-142-3p在卵巢癌組織中表達明顯低于癌旁組織，提示miR-142-3p可能是抑癌因子，能夠發揮抑癌作用。結果又發現過表達miR-142-3p能夠顯著抑制SKOV3 細胞的遷移和侵入能力，表明miR-142-3p具有抑制卵巢癌細胞侵襲和遷移的作用。

每一個miRNA通常會作用多個靶基因，通過對其調控而發揮不同的生物學功能。本研究通過生物信息學方法預測miR-142-3p結合HMGA2 mRNA的3’UTR。HMGA2高度表達于胚胎發育過程中，在很多成熟和分化的組織中幾乎不表達。有研究［15］發現，多種人惡性腫瘤中高表達HMGA2，HMGA2參與腫瘤細胞的不同活動。HMGA2過表達與乳腺癌和胰腺癌腫瘤等發生、發展有關［16-17］。已有文獻報道HMGA2參與腫瘤 （卵巢癌［18-19］等） 發生的不同步驟，本研究結果顯示，HMGA2與miR-142-3p在卵巢癌組織中的表達呈負相關，與以往研究結果一致。

本研究將miR-142-3p模擬物轉染SKOV3 細胞中，發現SKOV3 細胞的侵襲和遷移能力均下降；Transwell小室實驗結果表明HMGA2能夠降低miR-142-3p對卵巢癌細胞侵襲和遷移的抑制作用。說明miR-142-3p可能通過下調HMGA2基因來抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移，而HMGA2能夠增強腫瘤細胞的侵襲和遷移。

綜上所述，miR-142-3p表達增加能夠抑制SKOV3細胞中HMGA2 mRNA和蛋白表達，并抑制SKOV3細胞的生長和轉移。本研究對卵巢癌細胞遷移和侵入的機制進行了探討，為臨床治療卵巢癌提供了理論依據。