重度子癇前期胎盤組織中Staufen1的表達及其意義

陳小斌，李媛媛，黃嶺，喬寵

（ 中國醫科大學附屬盛京醫院婦產科，沈陽 110004）

子癇前期 （preeclampsia，PE） 是孕婦在妊娠期特有的疾病，嚴重威脅母胎健康。重度子癇前期 （severe preeclampsia，SPE） 及其并發癥，如胎盤早剝、腦出血、胎兒生長受限等，是導致孕產婦和圍產兒病死率升高的主要原因之一［1］。以孕34周為界，發病孕周＜34周為早發型重度子癇前期 （early-onset severe preeclampsia，ESPE），34周后為晚發型重度子癇前 期 （late-onset severe preeclampsia，LSPE）［2］。SPE病因至今尚不清楚，有學者［3］認為ESPE與滋養層細胞浸潤不足和子宮螺旋小動脈重鑄障礙有關；而LSPE與母體血管系統對妊娠的高敏感性和胎盤動脈硬化有關。MOL等［1］的研究表明，病理性妊娠時胎盤中某些相關蛋白出現異常表達，引起滋養細胞生物學行為失常，導致SPE發生。

Staufen蛋白是JOHNSTON在果蠅中發現的含有126個氨基酸的蛋白質，在果蠅胚胎發育過程中，參與細胞中mRNA的轉運和翻譯，屬于雙鏈RNA結合蛋白 （double-stranded RNA binding protein，DRBP） 家族。哺乳動物細胞中，Staufen 蛋白有2個同源蛋白，即Staufen1 （STAU1） 和Staufen2，其 中Staufen2蛋 白只在神經元細胞中表達，而STAU1蛋白在機體各組織中都有表達［4］。研究［4-6］表明，STAU1蛋白可以與細胞中mRNA的3’-非翻譯區 （3’-UTR） 結合，誘導mRNA降解，在細胞的發育、分化和凋亡中發揮著重要作用。研究［7］表明，STAU1蛋白還參與了胃癌的發生。胎盤滋養細胞的生物學行為與腫瘤細胞行為存在類似性，因此推測STAU1可能也參與了胎盤組織生物學行為的調節，并參與了SPE發生的調控。本研究擬通過檢測STAU1在SPE胎盤組織中的表達情況，探討其在PE發病中的作用，為臨床早期診斷和治療PE提供依據。

1 材料與方法

1.1 研究對象和分組

選取2016年5月至2018年4月在中國醫科大學附屬盛京醫院住院剖宮產分娩的SPE孕婦30例作為SPE組，并將其進一步分為ESPE組（15例）和LSPE組（15例）；另選同期剖宮產分娩的正常妊娠孕婦30例作為對照組 （N組） ，其中，孕周與ESPE組相對應者 （EN組） 10例，孕周與LSPE組相對應者 （LN組） 20例。SPE組和N組孕婦均為單胎、剖宮產分娩，排除生殖器官畸形、多胎及其他妊娠相關合并癥 （如妊娠期糖尿病、原發性高血壓、慢性腎炎等），其中，EN組常由宮頸機能不全、胎膜早破、前置胎盤、孕婦合并嚴重先天性疾病等病因而終止妊娠。

SPE的診斷標準依據《婦產科學》第8版［2］。本研究經中國醫科大學附屬盛京醫院倫理委員會批準 （倫理批號：2017PS230K），符合醫學倫理學規定，所有參加研究的孕婦及家屬均知情同意。

1.2 方法

1.2.1 標本收集：取剖宮產分娩后的無菌胎盤組織 （在胎盤母體面距離臍帶附著處2～3 cm范圍取材，避開機化灶、鈣化灶、出血灶等），用無菌生理鹽水反復沖洗，分割成1 cm×1 cm×1 cm組織塊，保存于液氮，用于提取RNA和蛋白質。另取1 cm×1 cm×1 cm組織塊，4%多聚甲醛保存，行石蠟包埋、切片，用于免疫組織化學檢測。

1.2.2 實時熒光定量 PCR （real-time PCR，RT-PCR）：取約50 mg胎盤組織，采用RNA iso試劑盒 （日本TaKa-Ra公司） 提取總RNA，檢測RNA濃度，采用5X-ALL-In-One RT MasterMix試劑盒 （加拿大abm公司） 逆轉錄生成cDNA。行PCR，95 ℃ 10 min；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min；95 ℃ 30 s，60 ℃ 15 s，40個循環，分析溶解曲線及循環閾值 （cycle threshold，Ct），每個樣本重復3次，取平均值。采用2-△△Ct法計算STAU1 mRNA經內參18S RNA標化后的相對表達水平。引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.3 Western blotting：取約50 mg胎盤組織，提取蛋白質，BCA法檢測蛋白濃度，變性后保存于-20 ℃。行凝膠電泳，轉膜60 min，5%脫脂奶粉封閉2 h后，加入兔抗人STAU1多克隆抗體 （1︰500稀釋，美國 Signalway公司） 和兔抗人GAPDH多克隆抗體 （1︰1 000稀釋，杭州賢至生物科技有限公司），4 ℃過夜。復溫30 min后，加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔抗體 （1︰5 000稀釋，北京中杉金橋生物技術有限公司） 孵育2 h。ECL顯色，應用Biosystems azure C300成像系統采集圖像并分析。

1.2.4 免疫組織化學檢測：取4%多聚甲醛固定后的胎盤組織，石蠟包埋48 h后，制石蠟切片，厚3～4 μm。采用免疫組織化學檢測試劑盒 （中國福州邁新生物技術開發有限公司 ） 行免疫組化染色。石蠟切片經脫蠟、封閉內源性過氧化物酶30 min，檸檬酸緩沖液抗原修復7 min，封閉非特異性抗原/電荷45 min，加入一抗 （STAU1 1︰200稀釋） ，4 ℃孵育10～12 h，二抗 （生物素標記的羊抗兔/鼠IgG） 孵育30 min，DAB顯色，蘇木素復染核3～5 min，棕黃色為陽性。應用NIS-Elements軟件 （日本Nikon公司） 對圖像進行采集分析。

1.3 統計學分析

2 結果

2.1 基本資料

ESPE組和EN組及LSPE組和LN組患者的年齡、孕周間均無統計學差異 （P ＞ 0.05），而ESPE組和LSPE組的收縮壓、舒張壓及24 h尿蛋白定量均顯著高于同期妊娠對照組，差異有統計學意義 （P ＜ 0.001）。見表2。

2.2 胎盤組織中STAU1 mRNA的表達情況

表2 患者的基本資料Tab.2 Basic data of patients

SPE組胎盤組織中STAU1 mRNA的表達水平 （0.844±0.074） 顯著低于N組 （1.096±0.057），差異有統計學意義 （P ＜ 0.01）；其中，ESPE組胎盤組織中STAU1 mRNA的表達水平 （0.683±0.061） 顯著低于EN組 （1.015±0.060），差異有統計學意義 （P ＜ 0.01），而LSPE組胎盤組織STAU1 mRNA表達水平 （1.005±0.124） 與LN組 （1.136±0.080） 比較無統計學差異 （P ＞ 0.05），見圖1。

2.3 胎盤組織中STAU1蛋白的表達情況

SPE組胎盤組織中STAU1蛋白的表達水平 （0.916±0.102） 顯著低于N組 （1.573±0.135），差異有統計學意義 （P ＜ 0.001）；其中，ESPE組胎盤組織中STAU1蛋白表達水平 （0.719±0.101） 顯著低于EN組 （2.025±0.155），差異有統計學意義 （P ＜ 0.001），而LSPE組胎盤組織STAU1蛋白表達水平 （1.112±0.165） 與LN組 （1.337±0.165） 比較無統計學差異 （P ＞ 0.05），見圖2。

圖1 胎盤組織中STAU1 mRNA表達水平Fig.1 STAU1 mRNA expression levels in different placental tissues

2.4 胎盤組織中STAU1蛋白的表達定位情況

圖2 胎盤組織中STAU1蛋白表達水平Fig.2 STAU1 protein expression levels in different placental tissues

4組胎盤組織的細胞滋養細胞和合體滋養細胞細胞中均有STAU1蛋白的表達，且主要在合體滋養細胞的細胞質中表達，其中ESPE組STAU1蛋白表達水平顯著低于EN組 （0.014±0.008 vs 0.019±0.002，P ＜ 0.001），LSPE組與LN組則無統計學差異 （0.011±0.001 vs 0.012±0.003，P ＞ 0.05），見圖3。

3 討論

PE是指妊娠20周后孕婦出現高血壓并存在多器官及系統受累，嚴重影響孕產婦及圍產兒健康，尤其SPE及其嚴重的并發癥是導致母嬰死亡的重要原因。研究［1］發現PE存在多因素、多機制、多通路發病機制，但具體的發病機制仍不明確。在妊娠早期，細胞滋養細胞促使子宮螺旋動脈發生重構，擬合并替代胎盤組織中的血管內皮細胞和部分血管平滑肌，使子宮螺旋小動脈從高排低阻狀態變成低排高阻狀態，建立有效的母體和胎兒之間的營養物質交換，維持母體正常妊娠及胎兒的正常發育。同時，滋養細胞浸潤行為受到時間和空間的嚴格調控，滋養細胞浸潤過淺可能會導致PE的發生［8］。目前，研究［3，9］發現多種基因參與滋養細胞浸潤能力的調控，如TINP-1、KIR2DL1、MMPs等。

圖3 胎盤組織中STAU1蛋白的表達定位Fig.3 Localization of STAU1 protein in different placental tissues

STAU1蛋白是一種含有多個雙鏈RNA的RNA結合蛋白［10］。SUGIMOTO等［11］研究發現，STAU1蛋白具有mRNA和長非編碼RNA的結合區域，能分別與其3’-UTR和5’-UTR端結合，參與mRNA的轉運、局部翻譯和RNA代謝、加工等生物學功能［12］。BONNET-MAGNAVAL等［13］研 究 發 現，STAU1還 是一種應激反應基因，正常生理情況下，STAU1 mRNA可以與內部核糖體進入位點 （internal ribosome entry sites，IRES） 相結合，啟動編碼細胞內質網中抗氧化蛋白mRNA的翻譯，使細胞具有抗氧化應激的保護作用。KRETZ等［6］研究發現，STAU1可與LncRNA相結合，并在人表皮細胞分化過程中發揮著重要的作用。SAKURAI等［14］研究發現，敲低STAU1能夠恢復ADAR1敲低引起的應激細胞凋亡，在胃癌細胞中，STAU1可與CDKN2B mRNA的3’-UTR結合，降解CDKN2B，促進胃癌細胞增殖［7］。提示STAU1在正常細胞及腫瘤細胞中發揮著重要的作用，而目前尚無關于STAU1在胎盤滋養細胞中的表達情況及其對SPE影響的研究。

本研究發現，STAU1 mRNA和蛋白在胎盤合體滋養細胞和細胞滋養細胞中均有表達，其中以合體滋養細胞為主；通過比較發現，SPE組 （ESPE組和LSPE組） STAU1 mRNA和蛋白的表達均低于N組，表明STAU1很有可能參與了SPE的發病機制，其中STAU1 mRNA和蛋白在ESPE組的表達低于EN組，提示STAU1可能與子宮螺旋小動脈重鑄障礙有關，導致滋養層細胞浸潤能力不足，從而參與PE的發?。欢鳯SPE組STAU1 mRNA和蛋白的表達與LN組無統計學差異，可能是由于LSPE的發生主要與內皮細胞損傷及胎盤動脈硬化、全身系統性免疫炎癥反應有關［15］，進一步說明STAU1蛋白可能在滋養細胞浸潤行為中發揮著重要的作用。

綜上所述，本研究結果表明，STAU1的表達水平可能與SPE的發病有關，尤其與ESPE的發生相關。