玉郎傘查爾酮對大鼠心肌缺血再灌注損傷后炎性反應的影響

覃斐章 秦秋華

[摘要] 目的 觀察玉郎傘查爾酮（YLSC）對大鼠心肌缺血再灌注后炎性反應的影響。 方法 將60只12周齡的SPF級SD大鼠按隨機數字表法分為假手術組（等體積生理鹽水），模型組（等體積生理鹽水），陽性組（葛根素注射液12.00 mg/kg），YLSC低劑量組（2.50 mg/kg）、中劑量組（YLSC 5.00 mg/kg）和高劑量組（YLSC 10.00 mg/kg），每組10只，雌雄各半。缺血1 h再灌注3 h復制大鼠缺血再灌注模型。假手術組只穿線不結扎。采用酶聯免疫吸附法檢測大鼠血清MB型肌酸激酶（CK-MB）、肌鈣蛋白（cTnI）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）的含量。伊文思藍和2，3，5-三苯基氯化四氮唑雙重染色確定心肌梗死面積。Western blot法檢測心肌高遷移率族蛋白1（HMGB1）、Toll樣受體4（TLR4）和核轉錄因子κB（NF-κB）。 結果 與模型組比較，YLSC能減少心肌酶CK-MB、cTnI的漏出（P < 0.05或P < 0.01），縮小心肌梗死面積（P < 0.05或P < 0.01），降低血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α的釋放（P < 0.05或P < 0.01），并抑制心肌HMGB1、TLR4、NF-κB的蛋白表達（P < 0.05或P < 0.01）。 結論 YLSC能減少大鼠缺血再灌注損傷，其心肌保護作用可能與減輕炎性反應，抑制心肌HMGB1、TLR4、NF-κB的蛋白表達有關。

[關鍵詞] 玉郎傘查爾酮;心肌缺血再灌注;高遷移率族蛋白1;炎性反應

[中圖分類號] R542.22? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-7210（2019）07（b）-0013-05

Effects of 17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofuran chalcone on inflammatory responses in myocardial ischemia reperfusion injury in rats

QIN Feizhang1? ?QIN Qiuhua2

1.Department of Pharmacology， College of Pharmacy， Guangxi Medical University， Guangxi Zhuang Autonomous Region，Nanning? ?530021，China; 2.Department of Pharmacy， Nanning Second People's Hospital， Guangxi Zhuang Autonomous Region， Nanning? ?530031， China

[Abstract] Objective To observe the effects of 17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofuran chalcone （YLSC） on inflammatory responses in myocardial ischemia reperfusion injury in rats. Methods Sixty 12-month-old SPF Sprague-Dawley （SD） rats were randomly divided into sham group （equal volume of normal saline）， model group （equal volume of normal saline）， positive control group （Puerarin Injection， 12.00 mg/kg） and YLSC low， medium and high-dose groups （2.50， 5.00， 10.00 mg/kg） via random number table method. The anterior descending coronary artery was ligated for 1 h then reperfused for 3 h to establish the ischemia reperfusion （I/R） model. Rats in sham group were applied stitches under the coronary artery without ligation. Levels of serum troponin I （cTnI）， creatine kinase-MB （CK-MB）， interleukin-6 （IL-6）， interleukin-1β （IL-1β） and tumor necrosis factor-α （TNF-α） were examined by enzyme-linked immunosorbent assay. The infarct sizes were measured by evans blue and 2， 3， 5-triphenyltetrazolium chloride staining. Protein levels of high mobility group box-1（HMGB1）， toll-like receptors 4 （TLR4） and nuclear factor-kappa B （NF-κB） in myocardiums were evaluated using Western blot. Results Compared with model group， YLSC reduced the leakage of myocardial enzyme CK-MB and cTnI （P < 0.05 or P < 0.01）， decreased myocardial infarction size （P < 0.05 or P < 0.01）， lower the release of serum inflammatory cytokines such as IL-6， IL-1β and TNF-α （P < 0.05 or P < 0.01）， and inhibited the protein expression of myocardial HMGB1， TLR4， NF-κB （P < 0.05 or P < 0.01）. Conclusion YLSC can reduce ischemia-reperfusion injury in rats， the myocardial protective effect may be related to reducing of inflammatory reaction， inhibiting the expression of myocardial related protein such as HMGB1， TLR4 and NF-κB.

[Key words] 17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofuran chalcone; Ischemia and reperfusion injury; High mobility group box-1; Inflammatory responses

缺血心肌恢復血流后組織功能代謝障礙，結構進一步破壞，甚至發生不可逆性損傷，稱之為心肌缺血再灌注（ischemia reperfusion，IR）損傷。IR機制復雜，其中細胞因子和炎癥因子的大量釋放起著重要的作用[1-3]。高遷移率族蛋白1（high mobility group box-1，HMGB1）是一種晚期致炎因子，可能參與了多種組織器官如心、腦、腎的IR進程。HMGB1促進細胞因子的趨化和游走，同時調控了很多編碼細胞因子的基因[4]，由于其具有作用持久的特點，針對HMGB1的治療比其他早期炎癥因子具有更寬泛的治療窗口期。

玉郎傘系豆科植物疏葉崖豆[Millettia pulchra（Dunn）Kurzvar.Laxior（Dunn）Z.Wei]的干燥根，為廣西壯、瑤醫常用藥材，用于治療風濕關節腫痛、中風偏癱，骨折及產后虛弱等[5]。17-甲氧基-7-羥基-苯并呋喃查爾酮（17-methoxyl-7-hydroxyl-benzofuran chalcone），簡稱“玉郎傘查爾酮”（YLSC），是從玉郎傘中提取的黃酮類化合物[6]。筆者前期的研究表明YLSC具有抗氧化、減少鈣超載和抗血小板聚集作用[7];筆者近期實驗尚發現，YLSC能抑制細胞凋亡，顯著下調NF-κB p65和Bax蛋白表達[8]，提示玉郎傘查爾酮抗IR的作用機制可能與抑制炎性反應有關，但作用機制并未完全清楚。葛根素臨床上用于心肌梗死、冠心病、心絞痛等心血管疾病的治療，有較好的療效。有研究發現，葛根素可減少缺血心肌中血清C反應蛋白的釋放，升高NO[9]，并通過核轉錄因子κB（NF-κB）信號通路抑制IR心肌細胞的損傷[10]。據此，本試驗選擇葛根素作為陽性對照藥，以評價YLSC對大鼠心肌IR損傷后炎性反應的影響，為藥物的進一步研發提供理論和實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

70只12周齡SPF級斯普拉格-杜勒鼠（Sprague-Dawley，SD）大鼠，雌雄不限，體重250～300 g，由廣西醫科大學實驗動物中心提供。試驗動物生產許可證：SCXK桂2014-0003，試驗動物使用許可證SYXK桂2014-0004。動物飼養環境溫度為（22±3）℃，相對濕度為50%～70%，12 h明暗交替，可以自由進食。

1.2 藥物與試劑

玉郎傘采自廣西壯族自治區靈山縣，經廣西中醫藥研究院賴茂祥研究員鑒定是蝶形花科植物疏葉崖豆Millettia pulchra var.Laxior的塊根。YLSC由廣西醫科大學藥理教研室提供，將玉郎傘飲片用60%乙醇進行微波輔助提取，萃取液濃縮得醋酸乙酯部位，采用多級柱層板、反復三氯甲烷-甲醇重結晶、制備液相色譜法對此部位進行純化得到YLSC單體，高效液相色譜法檢測純度為98%[6];葛根素注射液由山東華信制藥集團股份有限公司生產（規格：2 mL/0.1 g，批號：081003）;大鼠MB型肌酸激酶（CK-MB）、肌鈣蛋白（cTnI）、白細胞介素-6（IL-6）、白細胞介素-1β（IL-1β）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）測試試劑盒均購自北京北方生物技術研究所（批號：070152、18140506、201802137、201803241、017904）;抗HMGB1、抗Toll樣受體4（TLR4）、抗NF-кB抗體購自Santa Cruz Biotechnology公司（批號：T1784、3869M、S7806）;IgG-HRP、Immobilon-P試劑盒購自Pierce公司（批號：PN353820、SP562309）。

1.3 儀器

動物呼吸機器（上海奧爾科特生物科技有限公司）;722 s可見光分光光度計（上海儀電分析儀器有限公司）;Western電泳儀（美國Bio-Rad）。

1.4 方法

1.4.1 動物分組與給藥方式? 采用隨機數字表法將60只雌雄各半的SD大鼠隨機分為6組（每組10只）：①假手術組（生理鹽水）;②模型組（生理鹽水）;③陽性組（葛根素注射液，12.00 mg/kg）;④YLSC低劑量組（YLSC 2.50 mg/kg）;⑤YLSC中劑量組（YLSC 5.00 mg/kg）;⑥YLSC高劑量組（YLSC 10.00 mg/kg）。各組均按2 mL/kg體重尾靜脈給予相應藥物，1次/d，連續14 d。第14天給藥后10 min復制大鼠IR模型。

1.4.2 建立大鼠IR模型? 用10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，仰位固定于鼠板上。行氣管插管，連接小動物呼吸機，設置參數為呼吸頻率70次/min，呼吸比1∶2，潮氣量50 mL/kg。自胸骨左側第4肋間開胸，剪破心包膜，暴露心臟，用5-0號縫合線結扎冠狀動脈左前降支（結扎線上連接PE10聚乙烯管）。缺血1 h后，剪開結扎線，取出聚乙烯管，再灌注3 h復制大鼠IR模型。假手術組僅穿線不結扎。以缺血時ST段抬高，再灌注時ST段下降>50%為造模成功標志[10]。

1.4.3 血清CK-MB、cTnI、IL-6、IL-1β、TNF-α濃度的測定? 實驗結束后腹主動脈取血，室溫靜置2 h后置于離心機中以轉速4000 r/min，離心半徑8 cm，離心10 min，吸取上清液并存儲于-20℃冰箱保存備用。嚴格按照試劑盒說明書，用酶聯免疫吸附法測定血清CK-MB、cTnI、IL-6、IL-1β、TNF-α的含量。

1.4.4 心肌梗死面積的測定? 再灌注結束后再次結扎冠狀動脈左前降支，于主動脈根部注射3%的伊文斯藍2 mL，待心臟染色均勻后迅速摘除心臟。沿房室溝將心臟切片，每片厚約2 mm。切片置于1% 2，3，5-三苯基氯化四氮唑（2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC）中37℃孵育15 min，梗死心肌組織不染色呈白色，正常心肌組織染成藍色，缺血心肌組織染成磚紅色。用Image J軟件測量并計算梗死區總面積（infarct sizes，IS）占缺血區總面積（area at risk，AAR）的百分比（IS/AAR）。

1.4.5 Western blot法檢測心肌HMGB1、TLR4、NF-кB的蛋白表達? 取40 μg心肌組織蛋白樣品，經SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉膜至聚偏氟乙烯膜上，加入相應稀釋倍數的一抗（HMGB1、TLR4、NF-κB的抗體體積比分別為1∶1000、1∶2000、1∶500），4℃孵育過夜。然后加入相應的二抗孵育1 h。用Image Lab軟件分析蛋白條帶的光密度值，以目的條帶的光密度值/內參GAPDH的光密度值作為蛋白的相對表達量。

1.5 統計學方法

采用SPSS 18.0統計學軟件進行數據分析，計量資料用均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P < 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 心肌IR模型

取70只SD大鼠制備心肌IR模型，其中6只結扎后發生心律失常死亡，2只結扎后心電圖J點升高不明顯，2只大出血死亡。剩余60只大鼠符合實驗要求，用于后續實驗，造模成功率為85.7%。

2.2 YLSC對大鼠血清CK-MB、cTnI含量和心肌梗死面積的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清CK-MB、cTnI的含量顯著升高（P < 0.01），IS/AAR增加（P < 0.01）;與模型組比較，陽性組和YLSC低、中、高劑量組大鼠心肌CK-MB、cTnI均減少（P < 0.05或P < 0.01），IS/AAR均縮小（P < 0.05或P < 0.01）。見表1。

2.3 YLSC對大鼠血清炎癥因子IL-6、IL-1β、TNF-α水平的影響

與假手術組比較，模型組大鼠血清中IL-6、IL-1β和TNF-α水平明顯增高（P < 0.01）;與模型組比較，陽性組和YLSC低、中、高劑量組大鼠血清IL-6、IL-1β、TNF-α水平均降低（P < 0.05或P < 0.01）。見表2。

2.4 YLSC對大鼠心肌HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達的影響

與假手術組比較，模型組心肌組織中HMGB1、TLR-4和NF-κB的表達量明顯增高（P < 0.01）;與模型組比較，陽性組和YLSC中、高劑量組心肌組織中HMGB1、TLR4和NF-κB的蛋白表達量明顯減少（P < 0.05或 P < 0.01）。見表3、圖2。

3 討論

心肌IR機制復雜，炎性反應起著關鍵的作用[11]。近期研究發現[12]，前炎癥因子如IL-6、IL-1β、TNF-α、IL-10、ICAM-1等在心肌IR時表達會突然增加，而采取治療措施減少前炎癥因子的釋放后，心肌細胞的損傷明顯減輕。本研究觀察到，相對于模型組，YLSC組能顯著降低血清IL-6、IL-1β、TNF-α的水平，且YLSC中、高劑量組更明顯，提示YLSC具有減少促炎因子表達的作用。

HMGB1是普遍存在于哺乳動物組織細胞中的非組蛋白染色體結合蛋白。HMGB1作為重要的內源性因子參與IR炎性反應[12-13]。大鼠IR實驗中觀察到，HMGB1于缺血后30 min升高，再灌注后30 min達高峰，并持續到再灌注后48 h[14]。臨床研究發現，HMGB1可在急性心肌梗死（AMI）發生后迅速從細胞內釋放，12 h達到高峰，并維持至AMI發生后7 d，提示HMGB1可作為AMI預測、療效觀察和和預后判斷的重要指標[15]。近年來多項研究證實，通過抑制HMGB1的表達，可以減輕心肌IR的發生。Andrassy等[16]研究發現，IR前給予重組的HMGB1能增加心肌梗死面積，提高心肌TNF-α、IL-6含量，而HMGB1拮抗劑Box A則能減輕心肌IR損傷。HMGB1中和抗體和一些化合物（如丁酸鈉[17]、右美托咪啶[18]、胡黃連苷Ⅱ[19]等）也可以通過減少HMGB1的表達減輕炎性反應。抑制HMGB1的合成和釋放可能是調控心肌IR損傷的一個潛在的治療靶點。

Toll-like receptors（TLRs）受體是HMGB1的主要受體之一。TLRs有11種亞型，其中TLR4在心臟的分布密度最高[20]。HMGB1可與細胞膜表面的TLR4受體配型相結合，通過TLR4-MyD88依賴性途徑或TLR4-TRIF途徑激活NF-κB，促進其轉錄入細胞核內，進一步促進TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-8、ICAM和β干擾素等炎癥因子的活化和合成。而上述因子又反過來促進HMGB1的大量釋放，使炎性反應失控，形成瀑布式炎癥級聯反應，加速心肌損傷[12]。本研究結果發現，與模型組比較，YLSC預處理明顯降低心肌組織HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白含量。說明YLSC可以通過抑制HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白的表達，減輕心肌IR損傷的炎性反應，發揮心肌保護作用。

綜上所述，YLSC能減少心肌酶的漏出，縮小心肌梗死面積，減輕心肌IR時的炎性反應，起到心肌保護作用，其機制可能與抑制心肌HMGB1、TLR4、NF-κB蛋白表達，降低血清中IL-6、IL-1β、TNF-α濃度有關。

[參考文獻]

[1]? 蔡銀鏈，許朝祥，王耀國，等.白藜蘆醇通過抑制TNF-α的釋放緩解大鼠缺血再灌注心臟損傷[J].免疫學雜志，2018，34（11）：934-939.

[2]? 黃婷，李紹旦，李涵，等.通心絡干預肥大細胞脫顆粒誘導的炎癥反應對缺血再灌注心肌的保護機制[J].中西醫結合心腦血管病雜志，2017，15（23）：2973-2976.

[3]? 陳福暉，劉達，興容松.心肌缺血再灌注損傷發生機制的研究進展[J].安徽醫藥，2017，21（12）：2145-2148.

[4]? 趙麗華，尹宏磊，呂風華，等.HMGB1對缺氧復氧環境下心肌細胞凋亡的影響及機制研究[J].實用預防醫學，2018， 25（6）：746-750.

[5]? 廣西壯族自治區衛生廳.廣西中藥材標準[S].南寧：廣西科學技術出版社，1992：31-32.

[6]? 簡潔，張士軍，邱莉，等.壯藥玉郎傘查爾酮類成分的研究[J].中國醫院藥學雜志，2010，30（20）：1734-1737.

[7]? 覃斐章，簡潔，林興，等.17-甲氧基7-羥基-苯并呋喃查爾酮對大鼠凝血功能和血小板聚集的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（13）：197-200.

[8]? Jie J，Qing FZ，Zhang SJ，et al. The effect of 17-Methoxyl-7-hydroxy-benzene-furanchalcone isolated from Millettia Pulchra on myocardial ischemia in vitro and in vivo [J]. Planta Medica，2012，78（12）：1324-1331.

[9]? 柳挺.葛根素對心肌缺血再灌注損傷大鼠血清CRP、NO和CK含量的影響[J].中醫臨床研究，2018，10（28）：12-13.

[10]? 周英，朱瀅，楊建宇.葛根素通過核轉錄因子κB信號通路抑制缺血再灌注心肌細胞損傷的機制研究[J].中國臨床藥理學雜志，2016，32（8）：700-701.

[11]? 黃丹，段鈺萍，王學東，等.丹參川芎嗪注射液對嚴重創傷患者炎性因子影響及預防膿毒癥效果[J].現代中西醫結合雜志，2017，26（10）：1069-1071.

[12]? Xu X，Liang T，Lin X，et al. Effect of the Total Extract of Averrhoacarambola（Oxalidaceae） Root on the Expression Levels of TLR4 and NF-κB in Streptozotocin-Induced Diabetic Mice [J]. Cell Physiol Biochem，2015，36（6）：2307-2316.

[13]? Scaffidi P，Misteli T，Marco E，et al. Release of chromatin protein HMGB1 by necrotic cells triggers inflammation [J]. Nature，2002，418：191-195.

[14]? 林運靈.高遷移率族蛋白1在大鼠缺血再灌注損傷中的作用及丙酮酸乙酯的療效[D].福州：福建醫科大學，2010.

[15]? Kohno T，Anzai T，Naito K，et al. Role of high-mobility group box 1 protein in post-infarction healing process and left ventricular remodeling [J]. Cardiovasc Res，2009， 81（3）：565-573.

[16]? Andrassy M，Volz HC，Igwe JC，et al. High-mobility group box-1 in ischemia-reperfusion injury of the heart [J]. Circulation，2008，117（25）：3216-3226.

[17]? Hu X，Zhang K，Xu C，et al. Anti-inflammatory effect of sodium butyrate preconditioning during myocardial ischemia/reperfusion [J]. Exp Ther Med，2014，8（1）：229-232.

[18]? Zhang JJ，Peng K，Zhang J，et al. Dexmedetomidine preconditioning may attenuate myocardial ischemia/reperfusion injury by down-regulating the HMGB1-TLR4-MyD88-NF-κB signaling pathway [J]. PLoS One，2017， 12（2）：1-15.

[19]? Li JZ，Xie MQ，Mo D，et al. Picroside Ⅱ protects myocardium from ischemia/reperfusion-induced injury through inhibition of the inflammatory response [J]. Exp Ther Med，2016，12（6）：3507-3514.

[20]? Frantz S，Kobzik L，Kim YD，et al. Toll4（TLR4） expression in cardiac myocytes in normal and failing myocardium [J]. J Clin Invest，1999，104（3）：271-280.