高效液相色譜法檢測不同施肥栽培黃芪的毛蕊異黃酮葡萄糖苷及黃芪甲苷含量

王亞麗，田曼，王昌利，顏永剛，張崗

黃芪為豆科植物蒙古黃芪［Astrɑgɑlus membrɑnɑceus（Fisch.）Bge.vɑr.mongholicus（Bge.）Hsiɑo］或膜莢黃芪［Astrɑgɑlus membrɑnɑceus（Fisch.）Bge.］的干燥根。黃芪含多種化學成分，毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷是其主要活性成分，具有抗炎、降血糖、調節免疫、強心和保護肝臟等作用，對心腦血管疾病，糖尿病及肝損傷等疾病有良好的療效［1-6］。據文獻報道，高星等［7］研究了氮、磷、鉀三種肥料元素的不同配比對黃芪中黃酮類及皂苷類成分的影響，張金文［8］研究了有機與無機復混配方肥不同施用量對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及黃芪甲苷含量的影響，而單施有機肥、化學肥及其施肥量對黃芪中主要有效成分毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量影響卻少見報道。《中藥材生產質量管理規范》（國家藥品監督管理局令第32號）要求施肥種類以有機肥為主，根據不同藥用植物生長發育的需求有限度地使用化學肥料。本實驗于2016年3—11月設計了有機肥和化學肥2種肥料種類的12種不同施肥處理，采用高效液相色譜法（HPLC）比較分析了黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及黃芪甲苷含量的差異，為進一步研究黃芪栽培中合理施肥提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1儀器Waters 2695高效液相色譜儀，Waters 2996二極管陣列檢測器（DAD），Waters 2420蒸發光散射檢測器（ELSD）。

1.2試藥黃芪藥材樣品采自甘肅省宕昌縣步長集團黃芪種植基地，經陜西中醫藥大學王繼濤高級實驗師鑒定為豆科植物蒙古黃芪的干燥根。

毛蕊異黃酮葡萄糖苷（批號10305-201702）、黃芪甲苷（批號10212-201603）對照品均購于南昌貝塔生物科技有限公司，質量分數均≥98%，實驗用水為杭州娃哈哈集團有限公司的娃哈哈純凈水，乙腈和甲醇為美國賽默飛世爾科技有限公司的色譜純，甲酸為天津市科密歐化學試劑有限公司的色譜純，其他試劑均為分析純。

1.3研究方法施肥實驗共設12個處理，肥料種類及施肥量的實驗設計見表1。2016年2月27日施肥，肥料作基肥，黃芪種苗于2016年3月4日移栽，栽培方式為不覆膜平地開溝栽植，小區之間開30 cm×50 cm溝，每小區面積為24 m2，采用南北行向，長×寬=6 m×4 m，實驗采用隨機區組設計，各處理重復3次，各處理田間管理水平相同。于2016年11月5日收獲，干燥后采用HPLC-DAD測定毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量，HPLC-ELSD測定黃芪甲苷含量。

表1 黃芪栽培采用施肥肥料的種類及施肥量

1.4色譜條件

1.4.1毛蕊異黃酮葡萄糖苷色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30℃；流動相為0.2%甲酸（A）-乙腈（B），梯度洗脫0～30 min，15%B→30%B；30～40 min，30%B→15%B；系統平衡時間10 min；流速1.0 mL/min；進樣量10 μL；檢測波長260 nm。

1.4.2黃芪甲苷色譜條件 色譜柱為Waters Symmetry C 18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫30 ℃；流動相為乙腈-水（32：68）；流速 1.0 mL/min；進樣量10 μL；ELSD漂移管溫度60℃，噴霧器溫度36℃，增益值130，供氣壓力172.38 kPa。

1.5對照品溶液的制備精密稱定毛蕊異黃酮葡萄糖苷1.65 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解作為對照品溶液C。精密稱定黃芪甲苷0.74 mg，置5 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，超聲溶解作為對照品溶液D。

1.6供試品溶液的制備將甘肅省宕昌縣黃芪藥材在50℃烘箱中干燥24 h，打粉，過45目篩，精密稱量粉末5.0 g，置500 mL圓底燒瓶中，精密加入80%甲醇200 mL，浸12 h后，加熱回流提取3次，每次1 h，過濾，濾液蒸干，加100 mL水溶解殘渣，將溶液轉移到分液漏斗中，石油醚萃取3次，每次200 mL，棄去石油醚層，將非石油醚層轉移到蒸發皿中，濃縮干燥，加甲醇定容到10 mL量瓶中，0.22 μm微孔濾膜過濾，取續濾液，即得。

1.7統計學方法采用Excel 2013、SPSS 19.0對數據進行處理分析，多組計量資料比較采用方差分析，組間多重比較使用最小顯著性差異法（LSD），兩計量資料關系采用線性回歸及相關分析，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1線性關系考察

2.1.1毛蕊異黃酮葡萄糖苷線性關系考察 將“1.5”項下對照品溶液C按“1.4.1”色譜條件依次進樣1、5、10、15、20、25 μL，重復測定3次，以進樣量為橫坐標（X），峰面積值為縱坐標（Y），線性回歸方程為：Y?1=3 022 248.15x+121 954.72，r1=0.999 9，P1＜0.001，相關性差異有統計學意義，表明毛蕊異黃酮葡萄糖苷在0.33～8.25 μg范圍內與峰面積線性關系良好。色譜圖見圖1。

2.1.2黃芪甲苷線性關系考察 將“1.5”項下對照品溶液D按“1.4.1”色譜條件依次進樣1、5、10、15、20、25 μL，重復測定3次，以進樣量的對數為橫坐標（X），峰面積的對數（Y）為縱坐標，線性回歸方程為：Y?2=0.981 1x+5.606 7，r2=0.999 0，P2＜0.001，相關性差異有統計學意義，表明黃芪甲苷在0.146～3.65 μg范圍內與峰面積線性關系良好。色譜圖見圖2。

2.2測定結果精密稱取不同施肥處理的黃芪粉末，按“1.6”項下方法制備供試品溶液，按“1.4”項下色譜條件進行測定，分別計算毛蕊異黃酮萄糖苷及黃芪甲苷含量。對不同施肥處理的各實驗小區單根重、毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量、毛蕊異黃酮葡萄糖苷積累量、黃芪甲苷含量和黃芪甲苷積累量進行方差分析。方差分析的結果表明，不同施肥各處理間差異有統計學意義（P＜0.01），說明不同施肥處理對黃芪單根重、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量有影響，結果見表2。

圖1 毛蕊異黃酮葡萄糖苷對照品（A）及黃芪樣品（B）色譜圖

圖2 黃芪甲苷對照品（A）及黃芪樣品（B）色譜圖

表2 不同施肥處理黃芪單根重、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量及積累量方差分析

進一步對各處理采用LSD法進行多重比較，結果見表3。處理B單根重最重，為（56.88±2.46）g，約為處理A的1.4倍，除了與處理F之間差異無統計學意義外，與其他處理均差異有統計學意義；毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量及其積累量均以處理B最高，分別約為處理A的4.6倍和6.3倍，處理F次之，分別約為處理A的4.4倍和5.6倍，處理B、F均與處理A差異有統計學意義；黃芪甲苷含量及其積累量均以處理F最高，分別約為處理A的2.6倍和3.4倍，其次為處理B，分別約為處理A的2.4倍和3.3倍，處理B、F之間差異無統計學意義，與處理A差異有統計學意義。施肥栽培的11種處理方式，毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的含量及積累量均顯著高于不施肥栽培（處理A），整體而言，處理B下的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的含量及積累量最高。

3 討論

3.1提取方法的考察通過查閱文獻發現，同時提取黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷成分主要是超聲提取和加熱回流提取［9-12］，提取溶劑多為甲醇和95%乙醇，本實驗為提高毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷提取率，在現有文獻的基礎上分別考察了超聲提取和加熱回流提取方法，同時還考察了不同提取溶劑、提取時間和提取次數對提取率的影響，最終結果表明，80%甲醇加熱回流提取3次，每次提取1 h效率最高。參照2015年版中國藥典中黃芪項下黃芪甲苷的含量測定方法，本實驗方法與藥典中的方法相比，省去了水飽和正丁醇萃取、氨試液及D101型大孔吸附樹脂柱洗脫步驟，簡化了樣品處理方法。

3.2含量測定結果分析實驗結果表明，相比不施肥處理，有機肥處理和化學肥處理對黃芪單株根重和黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷、黃芪甲苷的含量均有所增加，且各施肥處理下黃芪中的毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量均達到《中國藥典》2015年版一部的標準，黃芪甲苷含量在施尿素量為20 kg/667 m2和過磷酸鈣15 kg/667 m2處理下低于藥典標準，其余各施肥處理下的黃芪甲苷含量均達到《中國藥典》2015年版一部的標準，分析其原因可能是因為本實驗提取方法與藥典相比省去了氨試液洗脫，據文獻報道，氨試液可以將樣品中其他皂苷類成分在堿的作用下水解掉乙酰基而提高黃芪甲苷的含量［13］。由于本實驗未經過氨試液處理，從而降低了黃芪中其他皂苷類成分向黃芪甲苷的轉化，這更加準確地檢測出黃芪藥材中以原型存在的黃芪甲苷的含量。毛蕊異黃酮葡萄糖苷含量及積累量在施尿素量為10 kg/667 m2處理下最高，黃芪甲苷含量及積累量在施尿素量為10 kg/667 m2處理下居第2，兩種有效成分的含量及積累量均高于施尿素量為15 kg/667 m2和20 kg/667 m2，說明施尿素肥在一定范圍內有助于提高黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷的含量，但尿素施肥量過高反而不利于這兩種有效成分的積累。在單施有機肥和磷酸二銨中，整體而言，以施有機肥量為3 600 kg/667 m2處理下毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量相對較高，但對提高黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量的效果卻不及過磷酸鈣和尿素。

表3 不同施肥處理黃芪單根重、毛蕊異黃酮葡萄糖苷和黃芪甲苷含量及積累量（n=3）

總之，合理施肥對于改善藥材品質具有重要意義，本研究在不同施肥種類的基礎上，初步研究了不同施肥量對黃芪中毛蕊異黃酮葡萄糖苷及黃芪甲苷含量的影響，為進一步研究黃芪栽培的合理施肥提供實驗依據。